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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-97391
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2019/9739/


Visualisierung des Yersinia Typ-III-Sekretionssystems während der Zellinfektion und der Einfluss von Wirtszellfaktoren auf das Translokon

Visualization of the Yersinia type III secretion system during cell infection and the influence of host cell factors on the translocon

Nauth, Theresa

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SWD-Schlagwörter: Yersinia , Mikroskopie , Makrophage
Freie Schlagwörter (Deutsch): Zellinfektion , bakterielle Sekretionssysteme , Typ-3-Sekretionssystem , STED , SIM , TEM , Immungoldmarkierung , Rho-GTPasen
Freie Schlagwörter (Englisch): cell infection , bacterial secretion system , type 3 secretion system , STED , SIM , TEM , immunogold , Rho GTPases
Basisklassifikation: 42.15 , 42.30
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Aepfelbacher, Martin (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 22.03.2019
Erstellungsjahr: 2018
Publikationsdatum: 23.05.2019
Kurzfassung auf Deutsch: Pathogene Yersinien verfügen über das in bakteriellen Krankheitserregern weit verbreitete und hoch konservierte Typ-III-Sekretionssystem (T3SS oder Injektisom). Diese bakterielle Nanomaschine setzt sich aus den Komponenten Basalkörper, Nadel und Translokon/Porenkomplex (aufgebaut aus den Translokatoren YopB und YopD) zusammen und dient dem direkten Transport bakterieller Effektorproteine in die Wirtszelle. Bei Zellkontakt inseriert das Translokon in die Wirtszellmembran und bildet damit eine für die Effektor-Translokation essentielle Struktur. Dennoch sind viele Aspekte zur Translokationspore nicht ausreichend verstanden; so ist bislang unklar, ob das Translokon in direkter Verbindung mit der Injektisomnadel steht. Auch die Wirtszellfaktoren, welche die Ausbildung der Pore beeinflussen, sind noch nicht eingehend untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte das Translokon in Yersinia enterocolitica während der Wirtszellinfektion mithilfe hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie (SIM, STED) und Immungold-Elektronenmikroskopie visualisiert werden. Hierbei konnten Translokationsporen in Verbindung mit Nadel und Basalkörper innerhalb der gleichen Injektisome dargestellt werden, was auf einen einstufigen Prozess der Effektortranslokation hinweist. Die Translokatoren konnten inseriert in die Wirtszellmembran visualisiert werden und zeigten eine gruppierte räumliche Verteilung in Verbindung mit den infizierenden Bakterien. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Bildung der Translokationsporen in einem spezifischen Plasmamembran-assoziierten Wirtszellkompartiment initiiert wird, das die Bakterien von großen extrazellulären Proteinen wie Antikörpern abschirmt, aber zugänglich für kleinere Moleküle bleibt. Dieses als Prävakuole bezeichnete Kompartiment zeigte eine starke Anreicherung des Phosphoinositids PI(4,5)P2. Des Weiteren konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die aktive Rho-GTPase Rac1 als zellulärer Faktor die Bildung der Prävakuolen und damit verbunden die Ausbildung von Translokons stimulieren kann. Bei Infektionsversuchen wurde deutlich, dass auch der Wirtszelltyp einen großen Einfluss auf die Ausbildung des Translokons hat. So zeigte sich, dass bei Infektion von primären humanen Makrophagen deutlich mehr Bakterien bereits zu früheren Zeitpunkten Translokons ausbilden als bei Infektion von HeLa-Zellen. Darüber hinaus zeigte die STED-Mikroskopie eine erhöhte Anzahl von Translokons pro Bakterium bei der Infektion von Makrophagen.
Zusammenfassend konnten im Rahmen in dieser Arbeit Translokons als Teil vollständig assemblierter Injektisome in einem intrazellulären Kompartiment humaner Makrophagen visualisiert werden. Diese Ergebnisse geben neue Einblicke in die Ausbildung der Translokationspore und ihre Regulation durch Wirtszellfaktoren.
Kurzfassung auf Englisch: Pathogenic Yersinia spp. employ a type III secretion system (T3SS or injectisome) to inject effector proteins into host cells. This bacterial nanomachine consists of basal body, needle and translocon/pore complex (consisting of the translocators YopB and YopD) and is highly conserved in numerous bacterial pathogens. The formation of the translocon, which is triggered by bacteria-host cell contact, and its integration into host cell membranes is a highly critical step for effector protein translocation. Yet, it remains unclear whether and how the translocon is physically connected to the injectisome needle. Also, the host cell factors affecting the formation of the translocon are poorly understood. In this work, the translocon of Yersinia enterocolitica could be visualized during host cell infection by using super-resolution fluorescence microscopy (SIM, STED) and immunogold electron microscopy. Super resolution microscopy showed the translocators in conjunction with the needle and the basal body within the same injectisome, suggesting a one-step process for effector translocation from the bacterial- directly into the host cell cytoplasm. It was demonstrated that the formation of the translocon is initiated in a specific plasma membrane-associated host cell compartment, which shields the bacteria from large extracellular molecules like antibodies but remains accessible to low-molecular substances. This compartment, called prevacuole, was characterized by a strong accumulation of the phosphoinositide PI(4,5)P2. Moreover, it was demonstrated that cellular factors such as the active Rho-GTPase Rac1 can stimulate the formation of the prevacuole and thereby increase the proportion of cell-associated bacteria forming translocons. Furthermore, infection experiments revealed that also the host cell type has a huge impact on the formation of translocons. Primary human macrophages could trigger the formation of translocons much more effectively than HeLa cells leading to a higher proportion of translocon forming bacteria already at earlier timepoints during infection. In addition, STED microscopy revealed higher numbers of translocons per individual bacterium during infection of macrophages.
In summary, in this study translocons were visualized as part of fully assembled injectisomes in Y. enterocolitica residing in a unique host cell compartment under physiological conditions. With these results novel insights into translocon formation and its regulation by host cell factors could be provided.

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