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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-97853
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2019/9785/


Analysis of SUMOylation in human Adenovirus large E1B proteins

Analysen zur SUMOylierung großer E1B Proteine in humanen Adenoviren

Kolbe, Viktoria

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Basisklassifikation: 42.32 , 42.15 , 42.13
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Dobner, Thomas (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 15.03.2019
Erstellungsjahr: 2019
Publikationsdatum: 07.06.2019
Kurzfassung auf Englisch: The human adenovirus (HAdV) type 5 from species C (HAdV C5) early region 1B 55 kDa (E1B 55K) is a multifunctional protein that plays an important role throughout the entire viral replication cycle. E1A, the first viral protein that is expressed, induces the cell to enter S phase, thereby stabilizing the apoptotic cellular protein p53 and supporting viral replication. E1B 55K evolved several mechanisms to counteract this stabilization of p53. On the one hand, E1B 55K acts as an E3 SUMO ligase for p53 promoting nuclear export of the protein. Thus, activation of proapoptotic p53 dependent genes is inhibited. On the other hand, E1B 55K forms an E3 ubiquitin ligase together with E4orf6 and other cellular proteins that degrade not only p53, but also other factors involved in the DNA damage response (DDR) and transcriptional regulation (Mre11, SPOC 1, Daxx). Thus, antiapoptotic and proviral functions grant E1B 55K an oncogenic potential. Post translational modifications (PTMs) of E1B 55K additionally contribute to the functional diversity of the protein. E1B 55K is a phosphoprotein and a target of the SUMO conjugation machinery and phosphorylation at the C terminus is a prerequisite for efficient SUMOylation at lysine 104 (K104). Interestingly, many functions of E1B 55K are regulated by its SUMOylation, indicating that this PTM is essential for the protein. To further investigate SUMOylation of E1B 55K, a site specific SUMO proteome was performed. Thereby, a lysine at position 101 (K101) was revealed as a potential new site for SUMO conjugation. K101 is in close proximity to the main SUMO conjugation motif (SCM) around lysine 104 (K104), therefore being an interesting new target and thus subject of this work.
In the first part, lysine 101 (K101) was identified as a regulator for E1B 55K SUMOylation. Remarkably, inactivation of this site via an amino acid exchange (K101R) resulted in an increased SUMOylation of the protein. In concert with previous studies, higher SUMOylation revealed a mainly nuclear retention of the protein and a clear localization to structures resembling viral replication centers (RCs) in infection experiments. Consequently, as SUMOylation promotes E1B 55K functions, stronger repression of p53 stimulated transcription and increased focus formation in transformation experiments with the K101R mutant was observed.
The second part of this work concentrated on E1B 55K from different HAdV species. Here, a conserved SCM in E1B 55K from nearly all HAdV species was identified. Furthermore, K101 is specific for HAdV C, since other HAdV species with a SCM contain an arginine at the corresponding site. Comparable to HAdV C5 E1B 55K K101R, E1B 55K from almost all species analyzed in this work revealed a high SUMOylation together with a mainly nuclear localization. However, E1B 55K dependent repression of p53 transactivation is rather conserved among HAdV species, whereas E3 SUMO1 ligase function is not. Moreover, SUMOylation functions as a regulator for E1B 55K in most, but not all HAdV species. The results of this work suggest that E1B 55K evolved conserved functions across HAdV species that slightly differ depending on the species and possibly pathogenicity.
Kurzfassung auf Deutsch: E1B 55K (early region 1B 55 kDa) der humanen Adenoviren Spezies C Typ 5 (HAdV C5) ist ein frühes multifunktionelles Protein, das eine entscheidende Rolle während des gesamten viralen Replikationszyklus spielt. Das erste exprimierte virale Protein E1A unterstützt die virale Replikation durch die Induktion der S Phase. Dabei wird das zelluläre pro apoptotische Protein p53 stabilisiert. E1B 55K entwickelte mehrere Mechanismen, um dieser Stabilisierung entgegenzuwirken. Zum einen dient E1B 55K als E3 SUMO Ligase für p53 und transportiert das Protein aus dem Nukleus, um die Aktivierung der pro apoptotischen p53 abhängigen Gene zu inhibieren. Zum anderen bildet E1B 55K zusammen mit E4orf6 und weiteren zellulären Proteinen einen E3 Ubiquitin Ligase Komplex, der neben p53 auch andere zelluläre Faktoren abbaut. Dazu gehören unter anderem Mre11, SPOC 1 und Daxx, die sowohl an der DNA Schadensantwort (DNA damage response; DDR) als auch an der Transkriptionsregulierung beteiligt sind. Diese anti apoptotischen und proviralen Funktionen führen zum onkogenen Potential von E1B 55K. Darüber hinaus erhöhen post translationale Modifikationen (PTMs) an E1B 55K seine funktionelle Vielfalt, die wiederum durch gegenseitige Regulation der PTMs nochmal erhöht wird. Interessanterweise werden viele Funktionen von E1B 55K durch SUMOylierung reguliert, was darauf schließen lässt, dass diese Modifikation ein essentieller Bestandteil für das Protein ist. Um diesen Sachverhalt noch besser zu verstehen, wurde E1B 55K mittels Massenspektrometrie genauer untersucht. Dabei wurde unter anderem ein Lysin an Position 101 (K101) als potentielles neues SUMO Konjugationsmotiv (SUMO conjugation motif; SCM) entdeckt. Die Nähe von K101 zum eigentlichen SCM um das Lysin 104 (K104) machte diese Position besonders interessant. Daher ist K101 Gegenstand der Untersuchungen dieser Arbeit.
Im ersten Teil wurde K101 als Regulator der E1B 55K SUMOylierung identifiziert. Untersuchungen dieses Lysins durch einen Aminosäureaustausch (K101R) zeigten eine erhöhte SUMOylierung von E1B 55K. Übereinstimmend mit früheren Studien an E1B 55K Mutanten, die eine erhöhte SUMOylierung zeigen, wies E1B 55K K101R eine vermehrt nukleare Lokalisation auf. Außerdem zeigten Infektionsexperimente mit E1B 55K K101R, dass es in Strukturen lokalisiert, die mutmaßlich virale Replikationszentren (replication center; RC) darstellen. Funktionell ging die erhöhte SUMOylierung der K101R Mutante mit einer verstärkten Hemmung der p53 abhängigen Transkription sowie einer erhöhten Fokusformation in Transformationsexperimenten einher.
Der zweite Teil dieser Arbeit befasste sich mit E1B 55K von weiteren HAdV Spezies. Zunächst wurde ein konserviertes SCM in nahezu allen Spezies identifiziert. Zudem wurde gezeigt, dass K101 spezifisch für HAdV der Spezies C ist, da alle anderen HAdV Spezies ein Arginin an entsprechender Stelle aufwiesen. Vergleichbar mit HAdV¬ C5 E1B 55K K101R wurden die Proteine fast aller untersuchten Spezies stark SUMOyliert und lokalisierten meist im Nukleus. Ein Vergleich von E1B 55K der verschiedenen Spezies hinsichtlich der SUMO anhängigen Funktionen zeigt, dass die Hemmung der p53 vermittelten Transkription eher konserviert, während seine Funktion als E3 SUMO1 Ligase nicht konserviert zu sein scheint. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass E1B 55K speziesübergreifende konservierte Funktionen entwickelt hat, die allerdings je nach Spezies und mutmaßlich Pathogenität ein wenig voneinander abweichen.

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