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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-97989
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2019/9798/


Optimization of nanobodies for in vivo targeting of P2X7 ion channel on brain microglia and kidney T cells

Optimierung von Nanobodies für das In-vivo-Targeting des P2X7-Ionenkanals auf Mikroglia des Gehirns und Nieren-T-Zellen

Pinto Espinoza, Carolina

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SWD-Schlagwörter: Nanobodies , optimisation , engineering , blood brain barrier , ion channel , P2X7, microglia , T cells
Basisklassifikation: 44.45
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Koch-Nolte, Friedrich (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 01.03.2019
Erstellungsjahr: 2018
Publikationsdatum: 05.07.2019
Kurzfassung auf Deutsch: P2X7 ist ein homotrimerer Ionenkanal, der von Immunzellen exprimiert und durch extrazelluläres ATP geöffnet wird. Dies führt auf LPS-stimulierten Monozyten und Microglia zur Ausbildung des NALP3 Inflammasoms, der Prozessierung und Freisetzung des proinflammatorischen Zytokins IL1-b, und zur Ausbildung von Poren in der Plasmamembran. Nanobodies, die Antigen-bindenden Domänen der Kameliden Schwerekettenantikörper, weisen einige Vorteile gegenüber konventionellen Antikörpern auf: als lösliche Einzeldomänen können sie leicht in bi- oder multispezifischem Format produziert werden und ihre geringe Größe erleichtert die Gewebepenetration. Die Arbeitsgruppe Koch-Nolte Labor am UKE hat P2X7-antagonisierende Nanobodies entwickelt, die bei entzündlichen Erkrankungen im Tiermodell therapeutische Wirkung zeigen. Allerdings ist bisher unklar, inwieweit diese Nanobodies den P2X7 Rezeptor auf der Oberfläche von Gewebe-residenten Immunzellen in vivo erreichen. Ziel dieser Arbeit war es, einen durchflusszytometrischen Assay zum Nachweis von injizierten, bzw. endogen im Organismus synthetisierten, P2X7-spezifischen
Nanobodies auf Gewebe-residenten Immunzellen zu entwickeln und damit zu klären, inwiefern Nanobodies in vivo endotheliale Barrieren überwinden können. Hierzu wurden die Bindungsstärke, die in vivo Halbwertszeit, die Löslichkeit, der isoelektrische Punkt und die P2X7-antagonisierende Funktion der Nanobodies durch Klonierung und gezielte Mutagenese optimiert. Nach Überprüfung dieser Parameter in Zellkulturmodellen in vitro, wurde in Pilotexperimenten im Mausmodell in vivo das Targeting von P2X7 auf cerebraler Microglia und renalen T Zellen durch injizierte bzw. endogen produzierte Nanobodies untersucht. Die Ergebnisse zeigen 4 Stunden nach intravenöser Injektion ein effizienteres Targeting von P2X7 auf renalen T-Zellen als auf cerebraler Microglia (EC50 ~100 μg/kg vs. 50 mg/kg). 18 Stunden nach intracerebroventrikulärer Injektion wurde auchmit deutlich niedrigeren Nanobody-Dosen eine weitgehende Sättigung von P2X7 aufMicroglia erreicht. Nach intramuskulärer Injektion von Nanobody-kodierenden AAVVektoren erzielten die endogen produzierten Nanobodies auch nach 6 Monaten noch eine weitgehende Sättigung von P2X7 auf renalen und cerebralen Immunzellen. Die Ergebnisse ermöglichen künftig ein besseres therapeutisches Targeting von P2X7 auf Immunzellen in Gehirn und Niere.
Kurzfassung auf Englisch: P2X7 is a homotrimeric ion channel expressed by immune cells. In LPS-primed myeloid cells such as monocytes and microglia, gating of P2X7 by ATP induces assembly of the inflammasome, leading to the release of mature interleukin IL-1β. Moreover, P2X7 activation leads to macropore formation in the plasma membrane. Nanobodies (Nbs) are a novel class of therapeutic proteins based on the antigenbinding domains of heavy chain antibodies that naturally occur in Camelids. Nanobodies offer advantages over conventional antibodies: (1) as soluble single domains they are easily reformatted into bi- and multispecific reagents, and (2) their
small size facilitates tissue penetration. The Koch-Nolte lab has generated Nbs that specifically antagonize P2X7 and show benefit in animal models of inflammation. The extent to which these nanobodies reach P2X7 on the surface of tissue resident immune
cells in vivo is not yet known. The goal of this study was to determine whether P2X7-antagonistic Nbs penetrate peripheral endothelial barriers and the highly restrictive blood brain barrier (BBB) to reach and bind P2X7 on tissue resident immune cells. P2X7-specific Nbs were sequence optimized to improve solubility and to raise the isoelectric point (pI), were dimerized by genetic fusion to increase binding affinity, and were genetically fused to an albumin-specific Nb to extend their in vivo half-life. Following the verification of the P2X7 antagonistic effects of the engineered Nbs in vitro, Nbs were intravenously (iv) or intracerebroventricularly (icv) injected at different doses into mice and the degree of P2X7 occupancy on brain microglia and renal T helper (Th) cells was evaluated by flow cytometry at different time points after administration. In parallel, the efficacy of the injected nanobodies to block ATP-mediated pore formation was analyzed. Following iv injections of nanobodies, a 100-fold higher dose was required to fully occupy P2X7 on brain microglia (150 mg/kg) than that on renal parenchymal Th cells (1.5 mg/kg). In contrast, 100-fold lower doses were sufficient to achieve full occupancy on microglia following icv administration of the same Nbs. In an alternative approach, muscle cells of mice were transduced with Nb-encoding AAV-vectors to induce long term in vivo expression of the engineered Nbs. The results showed that the endogenously produced Nbs (almost) fully occupied P2X7 on microglia and renal parenchymal Th cells 6 months after im injection of AAVs.

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