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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-99408
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2019/9940/


Design, Synthese und Analyse von nicht-ionischen Inhibitoren für die humane Blutgruppe-A-spezifische N-Acetylgalactosaminyltransferase (GTA)

Design, Synthesis and Analysis of Nonionic Inhibitors of the Human Blood Group A N-Acetylgalactosaminyltransferase (GTA)

Liao, Wei-Nien

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SWD-Schlagwörter: Blutgruppe , Inhibitor , Synthese
Freie Schlagwörter (Deutsch): Glycosyltransferase , donorsubstratanaloger Inhibitor , NMR basierter Enzymassay
Freie Schlagwörter (Englisch): glycosyltransferases , donorsubstrate analogue , NMR based enzyme assay
Basisklassifikation: 44.42 , 35.52
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Meyer, Bernd (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 05.07.2019
Erstellungsjahr: 2019
Publikationsdatum: 30.08.2019
Kurzfassung auf Deutsch: Glycane sind an vielen unterschiedlichen zellulären Vorgängen beteiligt. Vor allem bei der Zell-Zell-Interaktion, und Kommunikation spielen sie eine wichtige Rolle. Mit dieser wichtigen Aufgabe ist es nicht verwunderlich, dass eine Veränderung der Glycanstrukturen mit vielen verschiedenen Krankheiten im Zusammenhang gebracht werden kann. Es gibt zunehmende Beweise dafür, dass eine veränderte Glycanexpression mit der Tumorbildung in Verbindung steht und solche Veränderung sein invasives und metastasenbildendes Verhalten beeinflussen kann. Die Analyse der Glycanstrukturen hilft deshalb nicht nur die zellulären Prozesse zu verstehen, sondern gibt auch den Einblick in der Entstehung von bestimmten Krankheiten oder Tumoren, was zu Entwicklungen von diagnostischen und therapeutischen Methoden führen kann.
Die Vielzahl komplexer Glycanstrukturen wird durch sukzessive Beteiligung von mehreren Glycosyltransferasen (GTs) aufgebaut. Diese wichtige Klasse von Enzymen katalysiert hochspezifisch die Übertragung von NDP- oder NMP-aktivierten Kohlenhydraten auf einen bestimmten Akzeptor. Die Komplexität dieses Reaktionsmechanismus führt dazu, dass eine Entwicklung von Inhibitoren für Glycosyltransferasen äußerst schwierig und anspruchsvoll ist. Hinzu kommt noch die mangelnde Kenntnis über die dreidimensionale Struktur der meisten GTs und die Tatsache, dass die Glycosyltransferasen als Transmembranproteine meist im Golgi-Apparat lokalisiert und somit schwer für Inhibitoren zugänglich sind.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde basierend auf einem neuen, innovativen Konzept zur Entwicklung von spezifischen Inhibitoren für GTs, das an der humanen Blutgruppe-B-spezifischen Galactosyltransferase (GTB) als Modellsystem erfolgreich angewandt wurde, zwei neue, nicht-ionische Inhibitoren für die humane, Blutgruppe-A-spezifische N-Acetylgalactosaminyltransferase (GTA) entwickelt, synthetisiert und analysiert. Gleichzeitig konnte hier gezeigt werden, dass dieses innovative Konzept erfolgreich auch auf GTA übertragbar ist.
Bei den zwei Inhibitoren 12 und 13 handelt es sich um Mimetika des GTA-Donorsubstrats (UDP-GalNAc), die aus 9-N-Ribityl- bzw. Arabinityl-Harnsäure und N-Acetylgalactose, welche jeweils α-1-glycosidisch an den Pentityl-Linker koppeln, zusammengesetzt sind. Die beiden Mimetika unterscheiden sich nur in der Konfiguration am C-2 des Linkers. Durch computergestützte Analysen wurde gezeigt, dass die Mimetika 12 und 13 die Bindungstasche von GTA gut besetzen und das Donorsubstrat ersetzen konnten. Die beiden Mimetika konnten jeweils erfolgreich synthetisiert und anschließend auf ihr inhibitorisches Potential analysiert werden. Zudem gelang es beide Liganden mit den zwei unterschiedlichen Pentityl-Linkers experimentell zu untersuchen, um festzustellen, welcher davon hinsichtlich der Inhibition den besseren Linker darstellt. Für die Inhibitionsanalyse wurde ein NMR basierter Inhibitionsassay durchgeführt und durch die Analyse der daraus resultierenden Progresskurve der Enzymreaktion konnte die inhibitorische Konstante ermittelt werden. Es konnte erfolgreich gezeigt werden, dass beide Mimetika gut in der Lage sind, GTA zu inhibieren. Mit einem KI -Wert von 56 μM inhibiert 12 GTA um einen Faktor von 3.8 stärker als Ligand 13. Somit stellt sich das Ribityl als der bessere Linker dar.
Um die Spezifität der beiden Mimetika zu überprüfen, wurden ebenfalls NMR-basierte Inhibitionsassays mit GTB durchgeführt. Beide Mimetika weisen eine hohe Spezifität gegenüber GTA auf, was mit dem Vergleich der jeweiligen KI–Werte gegenüber GTA und GTB gezeigt werden konnte. Während die KI-Werte der Mimetika gegenüber GTB nur im einstelligen millimolaren Bereich liegen, sind die KI-Werte von 12 und 13 gegenüber GTA jeweils um einen Faktor von 161 bzw. 24 kleiner und befinden sich somit im mikromolaren Bereich. Es ist demnach gelungen, Inhibitoren zu synthetisieren, die spezifisch N-Acetylgalactosyltransferasen inhibieren. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass das verwendete, innovative Konzept auch auf GTA und vermutlich ebenfalls auf andere Klassen von GTs, die NDP-aktivierten Kohlenhydrate als Donorsubstrat benutzen, übertragbar ist.
Schließlich konnte im letzten Teil der Arbeit eine Möglichkeit zur Verbesserung der Bindungsaffinität von Mimetika 12 und 13 aufgezeigt werden. Das Ersetzen des UDP durch 9-N-Pentityl-Harnsäure hinterlässt einen leeren Raum in der Bindungstasche von GTA, welcher durch einen Propyl oder Hydroxyethylrest besetzt werden kann. Diese zusätzlichen Reste können an die 3-N- oder 6-N-Position der Harnsäure einfach oder doppelt verknüpft werden. Die daraus resultierenden Liganden 51 bis 73 zeigen in silico eine Erhöhung der Bindungsaffinität, die sich dem Wert des natürlichen Donorsubstrats UDP-GalNAc annähert. Zur schnellen experimentellen Überprüfung wurde zunächst 3-Propyl-1,7,9-trihydropurin-2,6,8-trion (81) synthetisiert, welches keinen Linker und Zuckerfragment enthält. Hierfür wurde ein allgemeiner Syntheseweg für einfach und doppelt alkylierte Harnsäurederivate entwickelt. Durch eine Progresskurvenanalyse konnte erfolgreich gezeigt werden, dass der zusätzliche Alkylrest einen deutlichen Beitrag zur Bindung leistet. Im Vergleich zur Harnsäure selbst ergibt sich eine Verbesserung um den Faktor 15 bis 31.
Kurzfassung auf Englisch: Glycans are involved in many different cellular processes. They play an important role, especially in cell-cell interactions and –communications, so it is not surprising that a mutation of glycan structures is associated with different diseases. Many studies show that an altered glycan expression is associated with cancer. These alterations might change the invasive and metastasis behavior of the tumor cell. Therefore, the analysis of glycan structure allows not only to understand cellular processes, but also to give an insight into the formation of related diseases, including cancer, in order to develop new diagnostic and therapeutic methods.
The wide varieties of complex glycan structures are formed with the successive participation of multiple glycosyltransferases (GTs). This important class of enzyme catalyzes the highly specific transfer of NDP- and NMP-activated carbohydrate to a designated acceptor. The complexity of this reaction mechanism leads to the fact that the development of glycosyltransferase inhibitors is extremely difficult and challenging. Additionally, there is a lack of information about the three-dimensional structure of most of the GTs, and the fact that glycosyltransferases as a transmembrane protein are mostly located in Golgi apparatus, therefore, difficult to access for inhibitors.
In this work two novel, non-ionic inhibitors for the human blood group A N-acetylgalactosyltransferase (GTA) was developed, synthesized and analyzed, based on a novel, innovative concept to develop specific inhibitors for GTs, which was successfully apply to the human blood group B galactosyltransferase (GTB) as a model system. Simultaneously, it can be shown that this innovative concept is applicable to GTA as well.
The two inhibitors 12 and 13 are GTA donor substrate UDP-GalNAc mimics, which consist of 9-N-ribityl or arabinityl uric acid, and N-acetylgalactose, interconnected at the pentityl fragment through a α-1-glycosidic linkage. These two mimics differ only in the configuration at C-2 of the linker. The in silico analysis shows that the mimics 12 and 13 are able to occupy the binding site of GTA quiet well and can replace the donor substrate. The two mimics were successfully synthesized and their inhibitory potential subsequently analyzed. Furthermore, two ligands with different pentityl linker could be analyzed in order to determine, which linker has the greater potential. For the inhibition analysis, an enzyme inhibition assay was conducted, which uses NMR to track the enzyme reaction. By analyzing the resulting progress curve, the inhibition constant can be calculated. Both mimics show a great inhibitory potential. 12 inhibits, with a KI -value of 56 μM, stronger than 13 by a factor of 3.8. Therefore, the ribityl is the better choice as a linker.
To verify the specificity of both mimics, the same enzyme inhibition assay was conducted with GTB as well. Both mimics show a high specificity towards GTA, as shown by comparing their KI–values of both GTA and GTB. While the KI–values of the mimics towards GTB lie within low range of millimolar, the KI–value of the mimics 12 and 13 towards GTA are by a factor of 161 and 24 smaller. Therefore, the synthesis of inhibitors, which inhibit specifically N-acetylgalactosyltransferases, was successful. At the same time, it shows that the innovative concept to develop specific inhibitors for GTs can be applied to GTA and probably to other GTs using NDP activated carbohydrate as donor substrate as well.
Finally, a way to improve the binding of mimics 12 and 13 was discovered. The substitution of UDP from the donor substrate by 9 N-pentityl leaves a void within the binding site, which can be occupied by a propyl or hydroxyethyl moiety. These additional moieties can be singly or doubly attached to uric acid at the 3-N or 6-N position. The resulting ligands 51 to 73 show in silico an increase of binding affinity, which approach the value of the natural donor substrate UDP-GalNAc. For a quick verification, 3-propyl-1,7,9-trihydropurine-2,6,8-trione (81), containing no linker and sugar fragment, was synthesized. For this purpose, a general synthesis route for single and double alkylated uric acid derivatives was developed. Subsequent progress curve analysis proofs that the additional alkyl moiety does indeed contribute to binding affinity. In comparison with uric acid itself, there is an improvement by a factor of 15 to 31.

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