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Titel: Structural characterisation of peroxisomal import receptor complexes
Sonstige Titel: Strukturelle Charakterisierung von peroxisomalen Import-Rezeptor-Komplexen
Sprache: Englisch
Autor*in: Giannopoulou, Evdokia- Anastasia
Erscheinungsdatum: 2017
Tag der mündlichen Prüfung: 2017-12-04
Zusammenfassung: 
Peroxisomes are dynamic eukaryotic organelles that require import of their membrane and matrix proteins by soluble receptors in the cytosol. Their biogenesis, protein import, and proliferation are regulated by a distinct set of proteins, collectively called peroxins.
Two peroxins, Pex3 and Pex19, are involved in the insertion of various Peroxisomal Membrane Proteins (PMPs) in the peroxisomal membrane and are thus crucial for its formation. Pex3 is a PMP that acts as a docking receptor for Pex19. The role of Pex19, in turn, is to bind, stabilise, and guide PMPs to the membrane-docked Pex3, where they are inserted into the peroxisomal membrane by an unknown mechanism. Pex14 is a PMP protein that is a key component of the peroxisomal import pore. Its interaction with Pex19 is established, yet little structural information is available about their full-length complex. In this thesis we investigated the conformation of the full-length human PEX19 in complex with the cytosolic domain of PEX3. A hybrid structural and biochemical approach was employed in order to characterize this interaction. Furthermore, the role of PEX19-PEX14 binding was addressed and the full-length complex was structurally characterised, providing insight into the stoichiometry, binding and shape of the never-before-described full-length assembly, using a variety of biochemical, biophysical and structural methods.
The second part of this thesis aims to shed light on the peroxisomal protein import mechanism process. Matrix proteins (cargoes) can be imported into the peroxisomal lumen using peroxisomal targeting signal 1 (PTS1), or peroxisomal targeting signal 2 (PTS2) import pathways. The PTS1 pathway is the most common, utilising peroxin Pex5p. Pex5p is a soluble receptor, cycling between a free cytoplasmic state -where it recognises and binds peroxisomal matrix proteins- and a membrane bound state, as part of the transient PTS1 pore. The interaction between Pex5p and cargo proteins occurs via the TPR domains (tetratricopeptide repeats) of Pex5p and the PTS1 sequence at the C-terminus of the cargo proteins. Two peroxisomal cargoes, Pcs60 and MIF1, were studied in this part of the PhD project. Pcs60 is a yeast peroxisomal oxalyl-CoA synthetase, while MIF1 is a plant peroxisomal cargo associated with stress response, both of which contain a PTS1 recognition signal peptide. These proteins were crystallised and structurally characterised by means of X-ray crystallography. Further characterisation of Pcs60 and its complex with Pex5p was performed by biophysical methods, small angle X-ray scattering (SAXS), and negative stain electron microscopy. Elucidation of the structure of the Pex5p-Pcs60 complex will lead to enhancing our understanding of peroxisomal protein import.

Peroxisomen sind dynamische eukaryotische Organellen, welche ihre Membran- und Matrixproteine über lösliche Rezeptoren im Cytosol importieren. Ihre Biogenese, Proliferation und der Import von Proteinen werden durch einen eigenen Satz von Proteinen reguliert, die als Peroxine bezeichnet werden.
Zwei dieser Peroxine, Pex3 und Pex19, spielen eine Rolle in der Integration verschiedener peroxisomaler Membranproteine (PMPs) in die peroxisomale Membran und sind daher entscheidend für ihre Bildung. Pex3 ist ein PMP, welches als Kopplungsrezeptor für Pex19 dient. Die Aufgabe von Pex19 hingegen ist, PMPs zu binden, zu stabilisieren und zu dem an die Membran gekoppelten Pex3 zu leiten. Dort werden sie durch einen unbekannten Mechanismus in die peroxisomale Membran eingefügt. Pex14 ist ein PMP, welches eine Leitkomponente der peroxisomalen Importpore darstellt. Seine Interaktion mit Pex19 ist bekannt, jedoch gibt es nur wenig strukturelle Information über den Volllängen-Komplex. In dieser Doktorarbeit untersuchten wir die Konformation des Volllängen-PEX19 in Komplex mit der cytosolischen Domäne von PEX3. Ein zweigleisiger, sowohl struktureller als auch biochemischer Ansatz kam zum Einsatz, um diese Interaktion zu charakterisieren. Zudem wurde sich mit der Funktion der PEX19-PEX14 Bindung und der strukturellen Charakterisierung des Volllängen-Komplexes befasst. Dabei wurden durch die Nutzung vielfältiger biochemischer, biophysikalischer und struktureller Methoden Einblicke in die Stöchiometrie, Bindung und Formgebung des nie zuvor beschriebenen Volllängen-Aufbaus erbracht.
Der zweite Teil dieser Doktorarbeit hat zum Ziel, Aufschluss über den Mechanismus des peroxisomalen Proteinimports zu geben. Matrixproteine (Kargos) können über den peroxisomale Targeting-Signal 1 (PTS1) oder den peroxisomalen Targeting-Signal 2 (PTS2) Importweg eingebracht werden. Der PTS1 Importweg, der Peroxin Pex5p nutzt, ist der gebräuchlichste. Pex5p ist ein löslicher Rezeptor, der zwischen einem freien cytoplasmatischen Zustand – wo er peroxisomale Matrixproteine erkennt und bindet – und einem membrangebundenen Zustand, als Teil der kurzzeitig auftretenden PTS1 Pore, wechselt. Die Wechselwirkung zwischen Pex5p und Kargo Proteinen entsteht über die TPR Domänen (Tetratricopeptid-Wiederholungen) von Pex5p und der PTS1 Sequenz am C-Terminus der Kargo Proteine. Zwei peroxisomale Kargos, Pcs60 und MIF1, wurde in diesem Teil des PhD Projektes untersucht. Pcs60 ist ein peroxisomale Oxalyl-CoA Synthetase in Hefe, während MIF1 ein pflanzlicher peroxisomaler Kargo ist, der mit Stressantwort in Verbindung gebracht wird. Beide enthalten ein PTS1 Erkennungssignalpeptid. Diese Proteine wurden kristallisiert und mittels Röntgenkristallographie strukturell charakterisiert. Weiterhin wurde Pcs60 und sein Komplex mit Pex5p durch biophysikalische Methoden, Röntgen-Kleinwinkelstreuung (SAXS) und Negativ-Kontrast-Elektronenmikroskopie charakterisiert. Die Aufklärung der Struktur des Pex5p-Pcs60 Komplexes öffnet die Tür zu einem verbesserten Verständnis über den peroxisomalen Proteinimport.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/7561
URN: urn:nbn:de:gbv:18-89919
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Lüers, Georg H. (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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