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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-25548
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2005/2554/


Transkriptomanalyse des visuellen Systems von Drosophila melanogaster (Meigen, 1830) mit Hilfe der DNA-Microarray-Technologie

Schramm, Guido

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SWD-Schlagwörter: Taufliege , Differentielle Genexpression , DNS-Microarray
Freie Schlagwörter (Deutsch): Drosophila melanogaster , FACS-Analyse , Microarray-Analyse , visuelles System , Transkriptom
Basisklassifikation: 42.13 , 42.63
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Gewecke, Michael (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 24.09.2004
Erstellungsjahr: 2004
Publikationsdatum: 25.07.2005
Kurzfassung auf Deutsch: Mit der 5´-RACE konnte eine auf der PCR basierende Strategie zur Analyse von vollständigen 5´-Enden einer cDNA verbessert und für die Anwendung etabliert werden (Schramm et al., 2000). Ausgangsprodukt dieser 5´-RACE ist eine CapFinder-cDNA. Eine modifizierte CapFinder-cDNA-Synthese ermöglicht die Synthese von cRNA (sense und antisense) und ist damit ein universelles Werkzeug für die Transkriptomanalyse auf der Basis geringster Probemengen. Die 5´-Enden sind insofern von besonderer Bedeutung, weil es nur durch sie möglich ist, den Leseraster eines Transkriptes exakt zu bestimmen. Nur durch die Kenntnis des exakten Leserasters sind z.B. die heterologe Expression und die in situ Detektion von mRNAs möglich.

Im Rahmen meiner Arbeit wurde die FACS-Analyse zur Isolierung einer distinkten Neuronenpopulation der Lamina verwendet. Mittels des Gal4/UAS Systems (Brand und Perrimon, 1993) wurde eine transgene Linie „L2“ generiert,welche GFP ausschließlich in L2-Zellen der Lamina exprimiert. Nach Kenntnislage der Literatur wurde diese Methode noch nicht bei Insekten verwendet. Aus einer inhomogenen Zellpopulation eines Lobenhomogenates wurden intakte L2-Neuronen isoliert. Die aus dieser Zellpopulation gewonnene RNA konnte mit der CapFinder-cDNA und der LA-PCR in eine stabile
L2-cDNA-Bibliothek umgeschrieben werden.

Basierend auf der CapFinder-cDNA konnten sowohl Retinatranskriptome als auch Laminatranskriptome von Drosophila melanogaster (Wildtyp und die Mutante sevenless) analysiert werden. Diese Transkriptome wurden auf DNA-Microarrays vom Typ Drosophila 7K Version 2 des Canadian Drosophila Microarray Centre CDMC hybridisiert und analysiert. Bei der Auswertung dieser Ergebnisse wurde ein besonderer Schwerpunkt auf die Analyse differenzieller Genexpression und auf die Identifizierung molekularer Komponenten der Signaltransduktions-Kaskaden im visuellen System von Drosophila m. gelegt. Durch die Transkriptomanalysen konnten die Expressionsorte von zwei unterschiedlichen Serotoninrezeptoren näher eingegrenzt und dadurch in einen physiologischen Zusammenhang gebracht werden. Aus der bei Insekten bekannten Gruppe der Serotoninrezeptoren wird ausschließlich 5-HT2 in der Retina exprimiert. Dort vermittelt dieser laut den von mir ermittelten Daten die Modulation eines Shaker Kaliumkanals, wie von Hevers und Hardie (1995) beschrieben. In der Lamina wird ausschließlich der 5-HT7 Rezeptor exprimiert. Dieser wurde mit einer möglichen Modulation des Histaminrezeptors in Verbindung gebracht. Ein von Gliazellen abgesondertes Acetylcholin-bindendes Protein (acetylcholine-binding protein, AChBP) wurde in der Lamina lokalisiert. Es handelt sich dabei um das Trankript CG1909, welches aufgrund der Analyse differenzieller Genexpression identifiziert werden konnte. Präsynaptische Acetylcholinabgabe induziert die Gliazellen, das AChBP in den synaptischen Spalt zu sezernieren. Dort moduliert es die cholinerge Neurotransmission (Smit et al., 2001). Dieses Ergebnis ist besonders interessant, weil ich zeigen konnte, dass drei unterschiedliche Untereinheiten für nikotinische Acetylcholinrezeptoren (nAcRbeta-64B =ARD, nAcRbeta21C und nAcRalpha-30D) in der Lamina exprimiert werden. Dieses war bisher nur für die ARD-Untereinheit bekannt. Die Untereinheiten nAcRbeta-64B und nAcRalpha-30 werden aber auch in der Retina exprimiert.

Basierend auf der CapFinder-cDNA-Synthese wurde eine neue Strategie der Subtraktiven Hybridisierung entworfen und experimentell überprüft. Eine Subtraktionsbibliothek Retina–Lamina wurde erstellt. Die Subtraktive Hybridisierung ist eine besonders wichtige Methode zur Identifizierung differenzieller Transkripte und ist von großer Bedeutung bei Arbeiten an Organismen, deren Genom nicht sequenziert wurde. Die diesbezüglichen Untersuchungen an Drosophila wurden deshalb als sinnvoll erachtet, weil die Effizienz der neu erdachten Strategie mittels der Array-Technologie leicht zu überprüfen ist.

Um möglichst umfassende Aussagen von Signaltransduktionsprozessen in distinkten Geweben oder Zellpopulationen von Drosophila melanogaster machen zu können, wurde ein so genannter Signaltransduktionschip (STDC) konzipiert und ansatzweise realisiert. Diverse cDNA-Proben, von bekannten und als wahrscheinlich eingestuften Genen der Signaltransduktion, konnten aus der Drosophila Wildtyp CapFinder-cDNA mittels der PCR amplifiziert und anschließend kloniert werden. Eine Testversion des STDC konnte produziert und mit cRNA hybridisiert werden. Eine anschließende Analyse fand nicht statt. Im Vordergrund standen zunächst die Produktion und die Beseitigung von Problemen experimenteller Natur. Jedoch konnte mit der Hybridisierung des STDCs gezeigt werden, dass das erdachte Gesamtkonzept zur Transkriptomanalsye auf Grundlage der CapFinder-cDNA erfolgreich durchführbar ist.

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