Organisation and transcriptional regulation of the polyphenol oxidase (PPO) multigene family of the moss Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. and functional gene knockout of PpPPO1

Abstract

Polyphenol oxidases (PPOs) are copper-binding enzymes of the plant secondary metabolism that oxidise polyphenols to quinones in the presence of molecular oxygen. Characterisation of seed plant PPOs suggested these enzymes to be involved in different processes, for example, in pest and pathogen defence mechanisms, in strong light stress response, in flower colouration, and in retardation of postmortem proteolysis. PPO-mediated promotion (re-oxidation) of enzymes involved in cytokinin degradation has further been hypothesised; yet, the in planta relevance of this involvement in hormonal regulation is unclear. A general function cannot be attributed to plant PPOs.

This work aimed to analyse PPOs in the basal land plant Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. It was demonstrated, that the bryophyte Physcomitrella exhibits PPO activity, and that part of the overall PPO protein is secreted to the culture medium. The Physcomitrella PPO gene family comprising twelve paralogues (PpPPO1 to PpPPO12) was identified and characterised. PpPPOs cluster in five groups with 2-3 PPOs each, and exhibit similarities but also differences to seed plant PPOs. Phylogenetic analyses revealed that PPO gene duplications within the monophyletic Physcomitrella gene family have occurred after separation from the seed plant lineage, and suggested that PPOs have evolved with the conquest of land, possibly with bacterial tyrosinases as ancestors. Physcomitrella PPO functionality was demonstrated for the example of recombinant PPO11, which showed o-diphenol oxidase activity, after expression in E. coli and subsequent polarographic enzyme assays using 4-methyl catechol as a substrate. The expression of the PPO gene family members, analysed by real-time RT-PCR, was shown to be differentially regulated under standard in vitro conditions and changed during the time course of a culture. Three PPO genes were not expressed in protonema tissue under standard conditions. The expression pattern of the PPO gene family changed drastically after strong light exposure (~1000 µmol m-2s-1), and the gene family members reacted differently to the irradiation. PPO4 and PPO12 gene expression was strongly upregulated, while expression of PPO1, -2, and -3 was decreased. Moreover, the PPO expression pattern also changed after incubation with the putative PPO substrate caffeic acid, revealing that the expression of most PPO genes was downregulated, whereas PPO1 and PPO8 expression was upregulated. Targeted Physcomitrella PPO1 knockout (PPO1_ko) plants were generated, and plants lacking PPO1 exhibited a ~60 % reduced extracellular PPO activity compared to wild type. Expression levels of the remaining PPO gene family members were shown to be regulated to a great extent independently from PPO1 under standard conditions as well as under strong light exposure, as PPO1_ko plants exhibited only slight changes in PPO2 to PPO12 expression. PPO1_ko lines were less tolerant towards externally applied 4-methyl catechol compared to wild type. Furthermore, abnormal protonema growth with shorter and roundly shaped chloronema cells was observed, and PPO1_ko plants produced significantly more gametophores than wild type. As gametophore formation is induced by cytokinins, in vivo cytokinin metabolism was monitored. PPO1_ko plants exhibited a reduced depletion of the applied tritiated cytokinin 3H-isopentenyladenine, suggesting a reduction of cytokinin breakdown catalysed by cytokinin oxidase/dehyrdogenase. HPLC-analysis of putative PPO substrates from tissue and culture medium revealed that Physcomitrella produced only little amounts of phenolic compounds under standard in vitro conditions. However, production of phenolic compounds and their secretion was induced by supplementing the culture medium with D-glucose.

From the obtained experimental data it was concluded, that the different members of the Physcomitrella PPO family are likely to possess different functions. PPO1 and possibly PPO8 might be involved in the establishment of appropriate extracellular conditions, like the removal of inhibitory extracellular phenolic compounds. PPO1 might further be involved in tuning of differentiation processes by promoting cytokinin degradation. Other PPOs might be involved in strong light response. Finally, the characterisation of a bryophyte PPO gene family opens new possibilities towards the understanding of PPO functions during the evolution of land plants.

Polyphenoloxidasen (PPOs) sind kupferhaltige Enzyme des pflanzlichen Sekundärstoffwechsels, die die Oxidation von Polyphenolen zu Chinonen katalysieren. Studien an Samenpflanzen zeigten, dass PPOs an verschiedenen Prozessen beteiligt sein können, z.B. bei der Pathogenabwehr, bei Mechanismen zum Schutz vor Starklichtschäden, bei der Bildung von Blütenfarben sowie bei der Hemmung der postmortem-Proteolyse. Darüber hinaus wurde angenommen, dass PPOs Cytokinin-abbauende Enzyme aktivieren können und somit indirekt auch an Differenzierungsprozessen beteiligt sein könnten, wobei die Relevanz dieses Prozesses in planta allerdings noch unklar ist. Eine generelle PPO-Funktion in Pflanzen ist nicht bekannt.

Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung von PPOs in der basalen Landpflanze Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. Es wurde gezeigt, dass Physcomitrella PPO-Aktivität besitzt und dass ein Teil der Gesamt-PPO-Aktivität in das Kulturmedium sekretiert wird. Mittels bioinformatischer Genomanalysen wurde die PPO-Genfamilie aus Physcomitrella identifiziert und charakterisiert. In silico-Analysen ergaben, dass sich die PPO-Genfamilie aus zwölf paralogen Genen (PpPPO1 bis PpPPO12) zusammensetzt, die in fünf Gruppen mit jeweils mit 2-3 PPOs angeordnet sind und sowohl Ähnlichkeiten als auch wesentliche Unterschiede zu PPOs aus Samenpflanzen besitzen. Phylogenetische Analysen zeigten, dass PPO-Genduplikationen innerhalb der monophyletischen Physcomitrella PPO-Genfamilie nach Abspaltung von der Abstammungslinie der Samenpflanzen stattgefunden haben. Außerdem lassen Metagenomanalysen vermuten, dass sich PPOs mit der Besiedlung des Landes entwickelt haben und möglicherweise aus bakteriellen Tyrosinasen hervorgegangen sind. Der funktionelle Nachweis für Physcomitrella-PPOs wurde am Beispiel von rekombinanter PPO11 erbracht, die nach Expression in E. coli und polarographischen Enzym-aktivitätsmessungen o-Diphenoloxidaseaktivität zeigte. Die Expression der PPO-Genfamilie in Protonemagewebe wurde mittels real-time RT-PCR untersucht. Die Expression der PPO-Gene war differenziell reguliert und veränderte sich im Verlauf einer Kultur. Drei PPO-Gene wurden unter Standardbedingungen nicht exprimiert. Unter Stark-lichtbestrahlung (~1000 µmol m-2s-1) veränderte sich das Expressionsmuster der PPO-Genfamilie drastisch, und die verschiedenen PPOs reagierten unterschiedlich auf die Bestrahlung. PPO4 und PPO12 wurden deutlich stärker exprimiert, während die Expression von PPO1, -2 und -3 stark vermindert wurde. Weiterhin veränderte sich das PPO-Expressionsmuster auch nach Inkubation mit dem putativen PPO-Substrat Kaffeesäure. Die Expression der meisten PPO-Gene wurde hierdurch herunterreguliert, wohingegen die PPO1- und PPO8-Expression gesteigert wurde. Physcomitrella PPO1-knockout-Pflanzen (PPO1_ko), die eine Reduktion der extrazellulären PPO-Aktivität um ~60 % im Vergleich zum Wildtyp aufwiesen, wurden hergestellt. Die Expression der übrigen PPO-Gene war unter Standard- und Starklichtbedingungen in hohem Maße unabhängig von PPO1, da PPO1_ko-Pflanzen im Vergleich zum Wildtyp nur geringfügige Unterschiede im Expressionsmuster von PPO2 bis PPO12 aufzeigten. PPO1_ko-Pflanzen besaßen im Vergleich zum Wildtyp eine geringere Toleranz gegenüber dem PPO-Substrat 4-Methylcatechol. Weiterhin wurde bei PPO1_ko-Pflanzen ein abweichendes Protonemawachstum mit kürzeren und rundlichen Chloronema-zellen beobachtet. PPO1_ko-Pflanzen produzierten darüber hinaus deutlich mehr Gametophoren als der Wildtyp. Da Cytokinine die Gametophorenbildung bei Laubmoosen induzieren, wurde der in vivo Cytokinin-Metabolismus untersucht. PPO1_ko-Pflanzen zeigten einen niedrigeren Verbrauch von exogen appliziertem, radioaktiv markiertem Cytokinin 3H-Isopentenyladenin, der möglicherweise auf eine reduzierte Aktivität des Cytokinin-abbauenden Enzyms Cytokininoxidase/dehyrdogenase zurückzuführen ist. HPLC-Analysen von putativen PPO-Substraten in Gewebe und Kulturmedium ergaben, dass Physcomitrella unter Standardbedingungen nur geringe Menge phenolischer Substanzen anreichert. Allerdings konnte die Produktion und Sekretion von phenolischen Substanzen durch den Zusatz von D-Glucose zum Kulturmedium induziert werden.

Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass die verschiedenen Physcomitrella PPOs unterschiedliche Funktionen besitzen. PPO1 und möglicherweise PPO8 könnten an der Erhaltung von geeigneten extrazellulären Bedingungen durch die Metabolisierung von inhibierenden phenolischen Substanzen beteiligt sein. Weiterhin könnte PPO1 durch eine Förderung des Cytokininabbaus indirekt Einfluss auf Differenzierungsprozesse haben. Andere Physcomitrella PPOs könnten in Starklicht-Reaktionen involviert sein. Aufgrund der phylogenetischen Schlüsselposition von Bryophyten, eröffnet die Charakterisierung der Physcomitrella PPO-Genfamilie neue Möglichkeiten, PPOs im Hinblick auf die Evolution der Landpflanzen zu untersuchen.