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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-83739
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2017/8373/


Calcium microdomains during T lymphocyte activation – role of second messengers and calcium channels

Calcium-Mikrodomänen während der Aktivierung von T-Lymphozyten - Rolle von sekundären Botenstoffen und Calciumkanälen

Diercks, Björn-Philipp

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SWD-Schlagwörter: Calcium , Lymphozyt , Calciumkanal , Botenmolekül , Immunsystem
Freie Schlagwörter (Deutsch): NAADP , Ryanodin Rezeptor
Freie Schlagwörter (Englisch): second messenger , calcium channel , ryanodine receptor , NAADP
Basisklassifikation: 35.71 , 42.15 , 42.13
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Guse, Andreas H. (Prof. Dr. Dr. habil.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 13.01.2017
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 15.02.2017
Kurzfassung auf Englisch: Activation of T lymphocytes is the fundamental on-switch of the adaptive immune sys-tem. Calcium (Ca2+) signaling is essential for T lymphocyte activation and is supposed to start by initial, localized Ca2+ microdomains. However, in contrast to excitable cells, in T lymphocytes such initial Ca2+ microdomains have not yet been characterized.
In this thesis, a new high resolution imaging method that allows for the first time to characterize initial Ca2+ microdomains in Jurkat T lymphocytes as well as primary mu-rine T lymphocytes, was developed (2.2; Wolf et al., 2015). A combination of two Ca2+ sensitive dyes (Fluo-4 and Fura Red) enables the fast acquisition (approx. 40 frames/sec) of Ca2+ microdomains despite cellular movement and changes in cell shape. Further, the Ca2+ signaling method is technically limited by an amplitude differences as low as 18 nM (Jurkat T lymphocytes) or 32 nM (primary T lymphocytes) at a calculated spatial resolution of ~368 nm. Using antibody-coated beads, with the size of T lympho-cytes, a cell-cell interaction could be mimicked and thus a directed activation of T lym-phocytes was obtained. Directly after contact with an antibody-coated bead, Ca2+ mi-crodomains were observed at the site of stimulation in Jurkat and primary wildtype (WT) T lymphocytes. Interestingly, the initial Ca2+ signals showed a bi-phasic pattern. In contrast, in ryanodine receptor (RyR) knockdown Jurkat and primary RyR1-knockout (KO) T lymphocytes the number of Ca2+ microdomains was significantly reduced and moreover, no bi-phasic pattern was detected.
Since in primary and Jurkat lymphocytes, initial Ca2+ microdomains were observed very close to the plasma membrane, an early Ca2+ entry component was considered to be involved. Since transient receptor potential channel, subfamily melastatin, member 2 (TRPM2) is a candidate channel for Ca2+ entry, primary murine TRPM2-KO T lympho-cytes were analyzed. However, there was no significant difference in the number of Ca2+ microdomains per cell and Ca2+amplitude compared to the primary murine WT T lymphocytes. Thus, TRPM2 seems not to be involved in the formation of initial Ca2+ microdomains in primary T cells.
To analyze the direct influence of NAADP on the initial localized Ca2+ signals, NAADP was directly microinjected in Jurkat T lymphocytes. In Jurkat T lymphocytes, initial Ca2+ signals after microinjection of NAADP were already observed after 20 msec fol-lowing a global activation of the cell. In RyR-knockdown Jurkat T lymphocytes neither initial Ca2+ signals nor a global activation was observed. Thus, already the initial, very fast Ca2+ signals were depend on functional RyRs, suggesting that the RyRs are directly targeted by NAADP.
Furthermore, the well established but time-consuming analysis workflow was automa-tized and implemented in MATLAB (MathWorks), resulting in a up to 24 times faster post processing time (2.1; Schetelig et al., 2015). During this process different deconvo-lution algorithms were compared and the bleach-correction of Fura Red was additional-ly optimized.
Taken together, the high resolution imaging method described here allowed for the first time to characterize initial Ca2+ microdomains in T lymphocytes and to obtain evidence for important roles of RyRs in such signals.
Kurzfassung auf Deutsch: Calcium (Ca2+) ist essentiell für die Aktivierung von T-Lymphozyten und somit für die Mobilisierung des adaptiven Immunsystems. Es wird vermutet, dass globale Ca2+ Signa-le aus initialen, lokalen Ca2+ Mikrodomänen entstehen. Bisher konnten solche initialen, lokalen Ca2+ Mikrodomänen aber nur in erregbaren Zellen charakterisiert werden nicht aber in T-Lymphozyten.
In der vorliegenden Doktorarbeit, wurde eine hochauflösende Ca2+ Life-Cell-Imaging Methode entwickelt, mit der es zum ersten Mal möglich war initiale Ca2+ Mikrodomä-nen in Jurkat T-Lymphozyten und primären Maus T-Lymphozyten zu charakterisieren (2.2; Wolf et al., 2015). Eine Kombination aus zwei Ca2+ sensitiven Farbstoffen (Fluo-4 und Fura Red) ermöglichte die Aufnahme von ca. 40 Bildern/sec, und dies obwohl sich die T-Lymphozyten bewegten und ihre Zell-Form veränderten. Mit der neuen Ca2+ Life-Cell-Imaging Methode war es möglich noch Differenzen in der Ca2+ Amplitude von bis zu 18 nM bei Jurkat und 32 nM bei primäre T-Lymphozyten zu unterscheiden und dies bei einem berechneten Auflösungsvermögen von ~368 nm. Um die T-Lymphozyten gerichtet zu aktivieren und somit eine Zell-Zell-Interaktion zu imitieren, wurden Beads, welche die Größe von Jurkat T-Lymphozyten besitzen, mit aktivierenden Antikörpern beschichtet. Direkt nach dem Kontakt mit solchen Antikörper-beschichteten Beads, konnten sowohl in Jurkat als auch in primären Wild Typ (WT) T-Lymphozyten Ca2+ Mikrodomänen, direkt an der Kontaktstelle, detektiert werden. Interessanterweise, konnte hierbei ein bi-phasisches Ca2+ Signal beobachtet werden. Sowohl in Ryanodine Rezeptor (RyR) knockdown Jurkat und primären RyR1-KO T-Lymphozyten war dage-gen die Anzahl der Ca2+ Mikrodomänen war signifikant reduziert und darüber hinaus konnte kein bi-phasisches Ca2+ Signal detektiert werden.
Da sowohl in den primären als auch in den Jurkat T-Lymphozyten die initialen Ca2+ Signale direkt an der Plasmamembran detektiert wurden, wurde vermutet, dass ein frü-her Ca2+ Einstrom an der Entstehung der Ca2+ Mikrodomänen beteiligt sein könnte. Da-her wurde zusätzlich Transient Rezeptor Potential Kanal, Subfamilie M, Subtyp 2 (TRPM2) als ein möglicher Ca2+ Einstrom-Kanal in der Plasmamembran untersucht. Es konnte aber kein signifikanter Unterschied in der Anzahl der Ca2+ Mikrodomänen und der Ca2+ Amplitude zwischen TRPM2-KO und WT T-Lymphozyten detektiert werden. TRPM2 scheint daher nicht an der Entstehung der initialen Ca2+ Mikrodomänen in T-Lymphozyten beteiligt zu sein.
Um den direkten Einfluss von NAADP auf die Entstehung der initialen Ca2+ Signale zu untersuchen, wurde NAADP direkt in Jurkat T-Lymphozyten mikroinjiziert. In Jurkat T-Lymphozyten konnten bereits nach 20 msec initiale Ca2+ Signale detektiert werden, welche nachfolgend zu einer globalen Aktivierung der Zelle führten. In RyR knock-down Jurkat T-Lymphozyten konnten weder initiale Ca2+ Signale noch ein globale Ak-tivierung der Zelle detektiert werden. Somit sind bereits die initialen Ca2+ Mikrodomä-nen abhängig von funktionalen RyR und NAADP scheint direkt auf die RyR zu wirken.
Zusätzlich wurde der etablierte, aber zeitlich gesehen sehr aufwendige, Analyse-Workflow automatisiert und in MATLAB implementiert (MathWorks), wodurch die Nachbearbeitungs-Zeit um das bis zu 24 fache beschleunigt werden konnte (2.1; Schete-lig et al., 2015). Außerdem wurden noch verschiedene Dekonvolutions-Algorithmen miteinander verglichen und die Bleichkorrektur von Fura Red optimiert.
Zusammenfassend konnte mit der neu etablierten hochauflösenden Ca2+ Life-Cell-Imaging Methode zum ersten Male initiale Ca2+ Mikrodomänen in T-Lymphozyten cha-rakterisiert werden und zusätzlich wurde der Einfluss der RyRs auf die Entstehung sol-cher Ca2+ Signale verdeutlicht.

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