Automatische PD-L1 Quantifizierung mittels künstlicher Intelligenz und einer 15-Marker BLEACH&STAIN Immunhistochemie in 3.098 humanen Karzinomen

Abstract

Maligne Tumorerkrankungen sind die zweithäufigste Todesursache weltweit. Der Erfolg von sogenannten Immuncheckpoint-Therapien hat ein besonderes Schlaglicht auf die Interaktionen von den Tumorzellen und den Zellen des Immunsystems geworfen. Unklar bleibt bislang jedoch, warum ein relevanter Anteil der Patienten nicht auf die bislang verfügbaren Therapien anspricht. Die Suche nach neuen Therapie-Zielproteinen und Markerproteinen zur verbesserten Vorhersage der Patientenprognose sowie des Therapieansprechens wird jedoch durch die Vielzahl der beteiligten Proteine und ihre komplexen Interaktionen massiv erschwert. Die aktuell in der Routinediagnostik etablierten Analyseverfahren erlauben nur die Untersuchung einzelner Marker, wodurch eine Ko-Expression und ein räumlicher Bezug verschiedener Proteine praktisch nicht erfasst werden kann. Dementsprechend besteht ein dringender Bedarf für neue Methoden, die eine gleichzeitige Untersuchung möglichst vieler Proteine und damit eine umfassende Darstellung des Tumormikromilieus erlauben. Die vorliegende Studie hatte deshalb zum Ziel, eine Methode zur Analyse des Tumormikromilieus zu etablieren, die sowohl in der Routinediagnostik als auch für die Hochdurchsatz-Gewebeanalyse in der Tumorforschung anwendbar ist. Die Tauglichkeit der Methode sollte für zwei Anwendungsbereiche validiert werden: Die Untersuchung der molekularen Epidemiologie verschiedener Tumor- und Immunproteine in vielen verschiedenen humanen Tumortypen, sowie die Suche nach neuen Prognosemarkern beim Mammakarzinom. Hierzu wurden Gewebemikroarrays mit mehr als 17.000 Gewebeproben 44 verschiedener Tumor- und Subtypen auf die Expression von mehr als 15 verschiedenen Proteinen des Tumor-Immun-Environments mittels spezieller adaptierter Multiplex-Fluoreszenz-IHC untersucht. Zur digitalen Bildanalyse wurden Verfahren des Deep Learnings der künstlichen Intelligenz angewendet und optimiert. Die biostatistische Auswertung wurde mit JMP 16.0.0- und R-Version 2021.09.1 durchgeführt. Als Ergebnis der Studie wurde das BLEACH&STAIN Verfahren entwickelt, welches auf der sequenziellen Anwendung mehrere Runden von Multiplex-Fluoreszenz-IHC beruht. Durch wiederholte Färbe- und Bleichzyklen konnten 15 verschiedene Antikörper (PD-L1, PD-1, CTLA-4, CD3, CD4, CD8, FOXP3, CD68, CD163, CD11c, iNOS, Ki67, CD20, CD31 und panCK) auf ein und demselben Gewebe- bzw. Tumorarray-Schnitt „parallel“ gefärbt werden. Zur Analyse der komplexen Färbungen wurde ein auf künstlicher Intelligenz-basierender Framework, der mehr als 20 verschiedene Deep Learning-Systeme (U-Net, DeepLabV3+) umfasst, entwickelt und validiert. Durch die automatisierte Analyse der Tumor-Mikroumgebung wurde die Charakterisierung von drei PD-L1-Phänotypen (PD-L1+ Tumor und Immunzellen [G1], PD-L1+ Immunzellen [G2], PD-L1 negativ [G3]), welche entweder „entzündet“ (G1.1, G2.1, G3.1) oder „nicht entzündet“ (G1.2, G2.2, G3.2) waren, ermöglicht. Patienten des entzündeten PD-L1+-Phänotyps (G1.1) wiesen eine erhöhte intratumorale CD68+CD163+ Makrophagen- und CD11c-dendritische Zell-Infiltration auf, die mit erhöhter PD-1 Expression, sowie fehlender Migration von T-Lymphozyten (CD3+CD4±CD8±FOXP3±) zum intraepithelialen Tumorkompartment, einherging (je p<0.001). Da von den Patienten mit Mammakarzinom Follow-up Daten vorhanden waren, konnte diese Entität auf die prognostische Relevanz von PD-L1 untersucht werden. Bei der Analyse dieser 587 Brustkrebspatienten konnte herausgefunden werden, dass nicht-entzündete PD-L1+-Patienten (G1.2, G2.2) eine schlechte Prognose aufwiesen (p<0,001). Die hier entwickelte BLEACH&STAIN Methode ermöglicht, in Kombination mit einem Deep Learning-basierten Framework für die automatische Quantifizierung von PD-L1 auf Tumor sowie Immunzellen, eine schnelle und umfangreiche Auswertung der Expression von PD-L1 auf verschiedenen Zelltypen und deren lokalitätsabhängigen Interaktionen zu inflammatorischen Zellen. Dieser Framework erlaubt die Identifikation von sechs unterschiedlichen PD-L1-Phänotypen, die von einem entzündeten PD-L1+-Tumorzell-Phänotyp (G1.1) mit einem intratumoralen T-Zell-Ausschluss zu einem nicht entzündeten PD-L1+-Immunzell-Phänotyp (G2.2) mit einer schlechten Prognose bei Brustkrebspatienten bis hin zu einem nicht-entzündeten PD-L1 negativen Phänotyp reichten (G3.2).