Nachweis, Lokalisation und Funktion von Polyphosphat im Endothel

Abstract

Anorganisches Polyphosphat (PolyP) ist ein Polymer bestehend aus wenigen bis hin zu einigen hunderten Orthophosphaten, welche durch energiereiche Phosphoanhydridbindungen verbunden sind. Beim Menschen spielt PolyP eine wichtige Rolle bei der Gerinnung, indem bei der Aktivierung von Thrombozyten an deren Zelloberfläche PolyP präsentiert wird und den Gerinnungsfaktor XII (FXII) dadurch aktiviert. Auch andere humane Zellen besitzen PolyP, jedoch ist die Lokalisation und Funktion bei vielen Zelltypen nicht erforscht. Ziel dieser Arbeit war es endogenes PolyP in Endothelzellen (EZs) nachzuweisen und subzelluläre Lokalisation sowie Funktionen von PolyP zu analysieren. Methodisch erfolgte zunächst die Detektion von endogenem PolyP in humaner Endothelzelllinie mittels des Malachite Green Assays. Ergänzend wurde hierzu PolyP in murinen und humanen Endothelzelllinien sowie Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) nach der neu überarbeiteten Methode der PolyP-Extraktion in der Urea-PAGE analysiert. Der Nachweis erfolgte hierbei jeweils durch den spezifischen Verdau des PolyPs durch die Exopolyphosphatase aus E. coli (PPX). Der mikroskopische in situ Nachweis der (sub-) zellulären Lokalisation wurde mit der PolyP-Sonde PPX_∆1,2 durchgeführt. Die PolyP-Sonde ist eine gentechnisch modifizierte Exopolyphosphatase und bindet an PolyP, hydrolysiert dieses jedoch nicht. Die Spezifität der Färbung wurde bestätigt durch eine kompetitive Hemmung von PPX_∆1,2 mittels synthetischem PolyP P70. Anhand konfokaler Fluoreszenzmikroskopie konnte weiter gezeigt werden, dass PolyP vor allem in den Mitochondrien der EZs lokalisiert ist, was die Verknüpfung mit ATP aufzeigen könnte. Des Weiteren wurde eine Ko-Lokalisation von PolyP und Nucleoli-ähnlichen Strukturen aufgezeigt. Dieses könnte auf eine mögliche Rolle von PolyP bei der Genexpression hinweisen. Außerdem wurde PPX_∆1,2 mutmaßlich in den Weibel-Palade-Körperchen (WPBs) von HUVECs angereichert, welche möglicherweise neben Von-Willebrand-Faktor (VWF) auch als Speicher für PolyP dienen könnten und somit auch die Hämostase beeinflussen. Xenotropic and Polytropic Retrovirus Receptor 1 (XPR1) ist der einzig bekannte Phosphatexporter in Metazoa und reguliert als Transmembranprotein auch den Gehalt von PolyP in Thrombozyten. Deshalb wurde eine siRNA-vermittelte Downregulation von XPR1 durchgeführt, um den endogenen Gehalt an PolyP zu modulieren und die Auswirkungen in EZs zu untersuchen. Wie erwartet akkumuliert PolyP nach dem Verlust von XPR1 auch in EZs und ein deutlicher Anstieg der mRNA der Proliferationsmarker CCNB1, CCNB2, MKI67 sowie MYBL2 wurde beobachtet. Dies kann ein Hinweis auf eine mögliche Funktion von PolyP bei der Proliferation sein. Außerdem war die Morphologie der Mitochondrien beeinträchtigt und der Gehalt an VWF intrazellulär gemindert. Hinsichtlich der Ziele dieser Arbeit konnte PolyP vor allem in den Mitochondrien der EZs nachgewiesen werden sowie mutmaßlich in Nucleoli-ähnlichen Strukturen und WPBs der HUVECs. Zudem besteht ein Zusammenhang zwischen XPR1 der HUVECs und dem PolyP-Gehalt der Zellen sowie der Proliferation. Weitere Funktionen von PolyP im Endothel müssen durch weitere Versuchsreihen analysiert werden.

Inorganic polyphosphate (PolyP) is a polymer consisting of a few to several hundred orthophosphates linked by energetic phosphoanhydride bonds. In humans, polyP plays an important role in coagulation. Activated platelets presenting their polyp at their cell surface and thereby activating clotting factor XII (FXII). Other human cells also possess polyP, but its localization and function in most other cell types has not been explored. The aim of this work was to detect endogenous polyP in endothelial cells (EZs) and to analyze subcellular localization and functions of polyP. Methodically, endogenous polyP was first detected in human endothelial cell line using the Malachite Green assay. In addition, polyP was analyzed in murine and human endothelial cell lines as well as human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) using the newly revised method of polyP extraction in urea-PAGE. In each case, detection was performed by specific digestion of polyP by exopolyphosphatase from E. coli (PPX). Microscopic in situ detection of (sub-) cellular localization was performed using the PPX_∆1,2 polyP-probe. The polyP-probe is a genetically modified exopolyphosphatase and binds to polyP but does not hydrolyze it. Specificity of staining was confirmed by competitive inhibition of PPX_∆1,2 using synthetic polyP P70. Using confocal fluorescence microscopy, it was further shown that polyP is mainly localized in the mitochondria of EZs, which could reveal the linkage with ATP. Furthermore, co-localization of polyP and nucleoli-like structures was revealed. This could indicate a possible role of polyP in gene expression. In addition, PPX_∆1,2 was putatively enriched in the Weibel-Palade-bodies (WPB s) of HUVECs, which could possibly serve as a store for polyP in addition to von-Willebrand-factor (VWF), thus also affecting hemostasis. Xenotropic and Polytropic Retrovirus Receptor 1 (XPR1) is the only known phosphate exporter in Metazoa and as a transmembrane protein, also regulates the level of polyP in platelets. Therefore, siRNA-mediated downregulation of XPR1 was performed to modulate the endogenous level of polyP and to study its effects in EZs. As expected, polyP also accumulated in EZs after loss of XPR1, and a marked increase in mRNA of the proliferation markers CCNB1, CCNB2, MKI67, as well as MYBL2 was observed. This may indicate a possible function of polyP in proliferation. In addition, mitochondrial morphology was impaired and VWF content was decreased intracellularly. Regarding the aims of this work, polyP was detected mainly in the mitochondria of EZs and putatively in nucleoli-like structures and WPBs of HUVECs. In addition, there is a correlation between XPR1 of HUVECs and polyP content of cells and proliferation. Additional functions of polyP in the endothelium need to be analyzed by further series of experiments.