Die Rolle der Glykogen-Synthase-Kinase-3β (GSK-3β) bei der Transformation hämatopoetischer Zellen

Abstract

In den letzten Jahrzehnten ist die personalisierte Tumortherapie ein wichtiges Instrument geworden, um Krebserkrankungen gezielter behandeln zu können. Hierfür ist ein detailliertes Verständnis der Pathophysiologie essentiell, um entsprechende Targets zu identifizieren und individualisierte Behandlungskonzepte zu etablieren. GSK-3 (GSK-3α und GSK-3β) ist eine ubiquitär vorkommende Kinase, deren Rolle im Hinblick auf die Entwicklung von Malignomen sowie ihr Wachstum seit Jahren kontrovers diskutiert wird. Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion der GSK-3β hinsichtlich ihrer Rolle bei der malignen Transformation von hämatopoetischen Zellen näher zu untersuchen. Hierfür wurden parentale Ba/F3-Zellen sowie Ba/F3-Zellen, die eine konstitutiv aktivierte katalytische Untereinheit der PI3-Kinase α (PI3KCA-H1047R) exprimieren, verwendet. Die PI3-Kinase liegt upstream der GSK-3 und führt durch Aktivierung der Proteinkinase AKT zu einer enzymatischen Inaktivierung der GSK-3. Eine konstitutiv aktive PI3-Kinase ermöglicht Ba/F3-Zellen IL-3-unabhängig zu wachsen. Die GSK-3β-Aktivität wurde durch Anwendung von GSK-3-Hemmstoffen, einer GSK-3β-spezifischen shRNA sowie durch ektope Expression mutierter, aktiver und inaktiver GSK-3β-Varianten moduliert. Nach Hemmstoff-Applikation zeigten parentale Ba/F3-Zellen eine starke, Dosis-abhängige Abnahme der Zellproliferation. Unter Anwendung der GSK-3β-spezifischen shRNA konnte dieser Effekt jedoch weder in der parentalen Zelllinie noch in Ba/F3-PI3KCA-H1047R-Zellen reproduziert werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die proliferationshemmenden Effekte der GSK-3-Inhibitoren in Ba/F3-Zellen auf die gleichzeitige Hemmung beider GSK-3-Isoformen oder auf generalisierte, anti-mitogene Effekte, nicht jedoch auf eine singuläre und spezifische Hemmung der β-Isoform zurückzuführen sind. Die ektope Expression einer aktiven GSK-3β-Variante (WT oder S9A) verminderte jedoch signifikant die Transformationsfrequenz in der Ba/F3-PI3KCA-H1047R-Zelllinie um den Faktor zwei während die ektope Expression inaktiver GSK-3β-Mutanten keinen Einfluss auf die PI3K-vermittelte Zelltransformation hatte. Weitere Untersuchungen zeigten, dass die Proliferation sowohl in parentalen Ba/F3-Zellen als auch in der Ba/F3-PI3KCA-H1047R-Zelllinie verringert war, sobald eine aktive Kinase-Variante exprimiert wurde. Die Apoptoserate der Zellen blieb im Gegensatz dazu unbeeinflusst. In Übereinstimmung hiermit konnte in den Zellen mit ektoper Expression einer aktiven Kinase-Variante eine signifikant veränderte Zellzyklusverteilung zugunsten der G1-Phase sowie eine um eine Stunde verminderte Geschwindigkeit beim Durchlaufen der G1-Phase des Zellzyklus nachgewiesen werden. Allerdings konnte im Rahmen dieser Arbeit der genaue, molekulare Mechanismus, über welche Zielmoleküle der Zellzyklus durch GSK-3β beeinflusst wird, nicht entschlüsselt werden. Hier sind weitere Untersuchungen notwendig, um die Rolle der GSK-3β abschließend zu klären. Hierbei sollte ein besonderes Augenmerk auf die Zellzyklusregulatoren Cylin D1 und p27Kip1 gelegt werden.

Weiterhin wurde in dieser Arbeit untersucht, ob GSK-3β in Ba/F3-Zellen einen Einfluss auf die Wirkung von Kinaseinhibitoren hat. Hier zeigte sich, dass die Expression aktiver GSK-3β-Varianten die Chemosensitivät der Zellen gegenüber dem AKT-Hemmstoff MK-2206 nicht beeinflusste, die Sensitivität der Zellen gegenüber dem mTOR-Hemmstoff Everolimus jedoch signifikant erhöhte. Diese Daten weisen darauf hin, dass GSK-3β eine Rolle in der Chemosensitivität hämatopoetischer Zellen gegenüber bestimmten Kinasehemmstoffen spielen könnte.

Insgesamt konnte gezeigt werden, dass GSK-3β im Ba/F3-Zellmodell eine negativ-regulatorische Funktion in der Regulation der zellulären Proliferation und der Induktion der PI3K-vermittelten Transformation in vitro ausübt. Die inhibitorische Funktion ließ sich auf eine verlangsamte Progression durch die G1-Phase und in der Folge auf eine Verschiebung der Zellzyklusverteilung zugunsten der G1-Phase zurückführen. Eine Beeinflussung der Regulation der Apoptose durch GSK-3β oder die Funktion eines Tumorsuppressors konnte in diesem Zellsystem nicht nachgewiesen werden, letzteres möglicherweise aufgrund einer Kompensation durch die α-Isoform. Weil GSK-3β einen zumindest partiellen Schutz vor einem unkontrollierten Wachstum vermittelt und darüber hinaus die hemmende Wirkung von Everolimus und wahrscheinlich weiterer Inhibitoren verstärkt, könnten GSK-3β-Agonisten für eine Behandlung hämatologischer oder anderer, maligner Neoplasien zukünftig in Betracht kommen.