Entwicklung eines DNA-Macroarrays zur molekularbiologischen Identifizierung handelsrelevanter CITES-Holzarten und ihrer Substitutionshölzer

Abstract

Der Handel mit gefährdeten Tier- und Pflanzenarten wird durch das „Washingtoner Artenschutzabkommen“ (CITES) reglementiert. Zu den gefährdeten Arten zählen auch wichtige Handelshölzer, die nach CITES-Richtlinien geschützt sind. Für die Umsetzung der Schutzregularien ist eine eindeutige Artidentifizierung unerlässlich, die die Entwicklung und den Einsatz effektiver Bestimmungsmethoden erfordert. Ziel der vorliegenden Forschungsarbeit war die Entwicklung eines genetischen Schnelltests zur Identifizierung geschützter tropischer Wirtschaftsbaumarten sowie ihrer Substitutionshölzer in Form eines DNA-Macroarrays. Dieser Test soll die bereits vorhandenen genetischen Nachweismethoden ergänzen und hiermit die Effektivität der Kontrollen verbessern. Untersucht wurden folgende sechs Handelssortimente CITES-geschützter Arten und ihre Substitutionshölzer: Echtes Mahagoni, Cedro, Bubinga, Pterocarpus-Arten, Ramin und Pockholz. Zur Entwicklung des Tests wurden nicht vorhandene Barcode-Sequenzen der ausgewählten Holzarten erstellt und darauf basierend Sonden (= Oligonukleotide) entwickelt. Anschließend wurden diese Sonden auf dem Macroarray überprüft. Als Ergebnis dieser Methodenentwicklung konnten die Einsatzmengen der Chemikalien reduziert und die Dauer des Verfahrens effektiv von 6,7 h auf 3,2 h verringert werden. Zur Artidentifizierung wurde der „internal transcribed spacer“ (ITS) als Barcode-Region gewählt und eine interne Datenbank aus 197 Sequenzen erstellt. Auf dieser Grundlage und öffentlich zugänglichen Datenbanksequenzen wurden 99 Sonden entwickelt und zusammen mit 49 weiteren Oligonukleotiden auf dem Macroarray getestet. Davon stellten sich 66 Sonden als geeignet heraus. Die Ergebnisse der Macroarray-Analysen zeigen, dass von den 53 untersuchten Holzarten 32 mit Hilfe des entwickelten Macroarray eindeutig identifizierbar sind. Weitere 15 Arten werden durch Gattungssonden repräsentiert und auf jeweils zwei bis maximal drei Arten innerhalb einer Gattung eingegrenzt. Für vier Arten ist über die erstellten Sonden keine Identifizierung möglich und zwei Arten konnten aus Mangel an zur Verfügung stehender DNA nicht überprüft werden. Die Vorteile der Macroarray-Methode für die Holzartenidentifizierung liegen in der parallelen Analyse mehrerer Arten, dem Verzicht auf eine Sequenzierung der DNA und eine Anwendung ohne eine vorherige Artenkenntnis. Außerdem bietet der entwickelte Test eine Möglichkeit der Zeit- und Kosteneinsparung im Vergleich zu derzeit verwendeten Methoden. Die im Rahmen der Promotion erzielten Ergebnisse zeigen erfolgsversprechend, dass der entwickelte Schnelltest durch seine Praxistauglichkeit einen Beitrag zur Bekämpfung des illegalen Holzhandels und der Einhaltung des Artenschutzes leisten kann.