Functional-structural characterization of phloem-mobile protein GRP8 in Arabidopsis thaliana

Abstract

Long-distance signaling, is permitted via the phloem system, is enabled by the translocation of small molecules. It is well established that RNA molecules are complexed with RNA-binding proteins (RBPs) forming ribonucleoprotein complexes (RNPs) in cells. The co-occurrence of different RNAs and RBPs in phloem exudate samples suggests their involvement in conferring RNA stability and mobility. RBPs are enriched in intrinsically disordered regions (IDRs) that are characterized by a low content of bulky hydrophobic amino acids and a high proportion of small, polar and/or charged amino acids. These intrinsic disordered proteins (IDPs) are characterized by the lack of defined structure either partially or completely, including IDRs. They possess the ability to fold into different conformations according to their binding partner in a wide range of interactions of high selectivity and low affinity. The presence of GRP8 as protein has been detected in phloem exudates of Arabidopsis thaliana. GRP8 structure consists of an RRM at the N-terminus and a low complexity glycine-rich domain at the C-terminus. GRP8 was studied in vitro in order to characterize its structure and function. For this, different approaches were performed including methods that are less common such as microscale thermophoresis (MST) and small angle x-ray scattering (SAXS). GRP8 was in vitro produced and purified. Protein production was achieved by the combination of several techniques that include cloning and expression of GRP8 and GRP8short in E. coli cells, protein extraction and purification. For further characterization assays, a truncated version of GRP8 was produced (GRP8short), which only included the RRM domain. After the purification of GRP8 and GPR8short, different assays were performed to elucidate the functionality of GRP8. RNA was extracted and isolated from phloem sap from B. napus and a CnBr-Sepharose GRP8-bound affinity column was performed. B. napus phloem sap was used instead of phloem sap from A. thaliana because this can only be obtained by EDTA-facilitated exudation or aphid stylectomy. These methods in A. thaliana can lead to poor sample quality because of contamination and low amount of phloem sap sample collection. In addition, it has been established that B. napus is a suitable model system for phloem sap analysis. The purity and integrity of the phloem-RNA was check by PCR and Bioanalyzer. Samples with contamination or RNA degradation were discarded. After conducting the CnBr-Sepharose GRP8-bound affinity column and analyzing the RNA-sequencing results, transcripts of interest were aligned through EnsemblPlants to find homolog transcripts in the A. thaliana genome. The CnBr-Sepharose GRP8-bound affinity column results showed that GRP8 was binding to a wide range of different RNAs. After the RNA-sequencing analysis, some enriched transcripts were selected and tested by MST to confirm if GRP8 binds them, and it was confirmed that GRP8 was binding all of them. GRP8 was also bound to UTRs of two different transcripts. In addition, a motif alignment was performed by the motif-based sequence alignment tool, nevertheless no common motifs were found, supporting that GRP8 is binding a wide range of RNAs. GRP8short was also tested, and it was observed that it was not binding any of the mRNAs from the RNA-sequencing analysis. Because GRP8short only includes the RRM, it was concluded that the glycine-rich domain plays a key role in RNA binding. GRP8 has been described as a IDP with a glycine-rich domain as a low complexity region including [G/S]Y[G/S] and RGG motifs. During protein purification of GRP8 three major hallmarks that either aggregated or degraded the protein were revealed: time length of the purification, protein concentration and environmental temperature. These appeared to be linked to the low complexity region of GRP8 and the presence of a PrLD in the glycine-rich domain. The reversibility of the aggregation was an indication of a liquid-liquid phase separation state. The PrLD behavior of GRP8 was tested by the Thioflavin T (ThT) and the liquid-liquid phase separation (LLPS) assay, where the formation of condensation droplets were observed. Nevertheless, the labeling of the protein is necessary to confirm the formation of an RNA granule. Structural characterization of GRP8 was performed by SAXS because of the IDP nature of GRP8. First, different temperatures were measured with GRP8 monomer in batch-SAXS where qualitative analysis was performed. Overall, when the environmental temperature was 5°C, aggregation indication of GRP8 was observed. Furthermore, SEC-SAXS was performed to understand the native structure of GRP8 monomer and dimer. GRP8 dimer versus GRP8 monomer results showed that the GRP8 monomer presents a more unfolded and disordered shape than GRP8 dimer. Although both proteins showed a similar behavior with the Kratky plots, a slight difference was observed between them. After the SEC-SAXS data was processed, it was proceeded to the 3D modeling of GRP8 monomer. The 3D model of GRP8 was presented and it represents the combination of different techniques including experimental data measured through SEC-SAXS and computational tools that were used to create this hybrid model of GRP8 monomer.

Die Signalübertragung über große Entfernungen, die über das Phloemsystem geschieht, wird durch die Translokation kleiner Moleküle ermöglicht. Es ist bekannt, dass sich RNA-Moleküle in Zellen mit RNA-bindenden Proteinen (RBPs) zu Ribonukleoprotein-Komplexen (RNPs) verbinden. Das gemeinsame Auftreten verschiedener RNAs und RBPs in Phloem-Exsudat-Proben lässt vermuten, dass diese für die Stabilität und Mobilität der RNA verantwortlich sind. RBPs sind in intrinsisch ungeordneten Regionen (IDRs) angereichert, die durch einen geringen Gehalt an sperrigen hydrophoben Aminosäuren und einen hohen Anteil an kleinen, polaren und/oder geladenen Aminosäuren gekennzeichnet sind. Diese intrinsisch ungeordneten Proteine (IDPs) zeichnen sich dadurch aus, dass ihnen eine definierte Struktur entweder teilweise oder vollständig fehlt, einschließlich der IDRs. Sie besitzen die Fähigkeit, sich in Abhängigkeit von ihrem Bindungspartner in verschiedene Konformationen zu falten, was zu einer Vielzahl von Wechselwirkungen mit hoher Selektivität und geringer Affinität führt. Das Vorkommen von GRP8 als Protein wurde in Phloem-Exsudaten von Arabidopsis thaliana nachgewiesen. Die Struktur von GRP8 besteht aus einem RRM am N-Terminus und einer Glycin-reichen Domäne mit geringer Komplexität am C-Terminus. GRP8 wurde in vitro untersucht, um seine Struktur und Funktion zu charakterisieren. Dazu wurden verschiedene Ansätze verfolgt, darunter auch weniger verbreitete Methoden wie die Thermophorese (MST) und die Kleinwinkel-Röntgenstreuung (SAXS). GRP8 wurde in vitro hergestellt und gereinigt. Die Proteinproduktion wurde durch die Kombination mehrerer Techniken erreicht, die das Klonen und die Expression von GRP8 und GRP8short in E. coli-Zellen, die Proteinextraktion und die Reinigung umfassen. Für weitere Charakterisierungsversuche wurde eine verkürzte Version von GRP8 (GRP8short) hergestellt, die nur die RRM-Domäne enthält. Nach der Reinigung von GRP8 und GPR8short wurden verschiedene Tests durchgeführt, um die Funktionalität von GRP8 zu klären. RNA wurde aus dem Phloem-Saft von B. napus extrahiert und isoliert, und es wurde eine CnBr-Sepharose-Affinitätssäule mit daran gebundenem GRP8 durchgeführt. Der Phloemsaft von B. napus wurde anstelle des Phloemsaftes von A. thaliana verwendet, da dieser nur durch EDTA-vermittelte Exsudation oder Blattlaus-Stylektomie gewonnen werden kann, die beide zu einer geringen Probenkonzentration und Kontamination führen. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass B. napus ein geeignetes Modellsystem für die Phloemsaftanalyse ist. Die Reinheit und Integrität der Phloem-RNA wurde mittels PCR und Bioanalyzer überprüft. Proben mit Verunreinigungen oder RNA-Degradation wurden aussortiert. Nach der Durchführung der CnBr-Sepharose GRP8-gebundenen Affinitätssäule und der Analyse der RNA-Sequenzierungsergebnisse wurden interessante Transkripte mit Hilfe von EnsemblPlants aligned, um homologe Transkripte im Genom von A. thaliana zu finden. Die Ergebnisse der CnBr-Sepharose-Affinitätssäule für GRP8 zeigten, dass GRP8 an ein breites Spektrum verschiedener RNAs bindet. Nach der RNA-Sequenzierungsanalyse wurden einige angereicherte Transkripte ausgewählt und mittels MST getestet, um zu bestätigen, dass GRP8 sie bindet, was für alle diese Transkripte zutraf. GRP8 wurde auch an UTRs von zwei verschiedenen Transkripten gebunden. Darüber hinaus wurde ein Motiv-Alignment mit einem motivbasierten Sequenz-Alignment-Tool durchgeführt, wobei jedoch keine gemeinsamen Motive gefunden wurden. Dies spricht dafür, dass GRP8 eine Vielzahl von RNAs bindet. GRP8short wurde ebenfalls getestet und es wurde festgestellt, dass es keine der mRNAs aus der RNA-Sequenzierungsanalyse bindet. Da GRP8short nur die RRM enthält, wurde gefolgert, dass die glycinreiche Domäne eine Schlüsselrolle bei der RNA-Bindung spielt. GRP8 wurde als IDP mit einer glycinreichen Domäne als Region geringer Komplexität beschrieben, die [G/S]Y[G/S] und RGG-Motive enthält. Bei der Proteinreinigung von GRP8 wurden drei Hauptmerkmale festgestellt, die entweder zur Aggregation oder zum Abbau des Proteins führten: Dauer der Reinigung, Proteinkonzentration und Umgebungstemperatur. Diese schienen mit der wenig komplexen Region von GRP8 und dem Vorhandensein einer PrLD in der glycinreichen Domäne zusammenzuhängen. Die Reversibilität der Aggregation war ein Hinweis auf einen flüssig-flüssigen Phasentrennungszustand. Das PrLD-Verhalten von GRP8 wurde mit dem Thioflavin T (ThT) und dem Flüssig-Flüssig-Phasentrennungs-Assay (LLPS) getestet, wobei die Bildung von Kondensationströpfchen beobachtet wurde. Dennoch ist die Markierung des Proteins notwendig, um die Bildung eines RNA-Granulums zu bestätigen. Die strukturelle Charakterisierung von GRP8 wurde aufgrund der IDP-Natur von GRP8 mittels SAXS durchgeführt. Zunächst wurden verschiedene Temperaturen mit GRP8-Monomer in Batch-SAXS gemessen und eine qualitative Analyse durchgeführt. Bei einer Umgebungstemperatur von 5°C eine Aggregation von GRP8 beobachtet. Darüber hinaus wurde eine SEC-SAXS durchgeführt, um die native Struktur von GRP8-Monomer und -Dimer zu verstehen. Die Ergebnisse des GRP8-Dimers im Vergleich zum GRP8-Monomer zeigten, dass das GRP8-Monomer eine stärker entfaltete und ungeordnete Form aufweist als das GRP8-Dimer. Obwohl beide Proteine ein ähnliches Verhalten in den Kratky-Diagrammen zeigten, wurde ein leichter Unterschied zwischen ihnen festgestellt. Nach der Verarbeitung der SEC-SAXS-Daten wurde mit der 3D-Modellierung des GRP8-Monomers fortgefahren. Das 3D-Modell von GRP8 wurde dargestellt und repräsentiert die Kombination verschiedener Techniken, einschließlich experimenteller Daten, die mittels SEC-SAXS gemessen wurden, und rechnerischer Werkzeuge, die zur Erstellung dieses Hybridmodells des GRP8-Monomers verwendet wurden.