Subfamilienübergreifende Interaktion von Kaliumkanal-Untereinheiten - Struktur-Funktionsanalysen am Beispiel von hKv2.1 und hKv6.2

Abstract

Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Identifikation eines konservierten Motivs, das subfamilienübergreifende Interaktion spannungsgesteuerter Kaliumkanaluntereinheiten vermitteln könnte. Untersucht wurde dazu die Bindung der regulatorischen α-Untereinheit hKv6.2 an hKv2.1. In vorhergehenden Arbeiten (Zhu et al., 1999) konnte im Hefe-Zwei-Hybrid-System nachgewiesen werden, dass für deren spezifische Bindung die jeweiligen Aminotermini hinreichend waren. Durch Konstruktion chimärer Proteine der Interaktionsdomänen T1A und T1B von hKv2.1 und hKv6.2 wurde versucht, im Hefe-Zwei-Hybrid-System zu ermitteln, welcher Abschnitt für die Interaktionsfähigkeit der Untereinheiten notwendig oder sogar hinreichend war. Es zeigte sich, dass bereits der Austausch von 28 Aminosäuren des NTerminus von hKv2.1 zu hKv6.2 ausreichte, damit das Protein die Bindungsfähigkeit sowohl an homomere Untereinheiten als auch an hKv6.2 verlor. Um die erforderlichen Residuen genauer einzugrenzen, wurden Struktur-Funktionsanalysen vorgenommen, die vom kristallisierten Modell von ShawT1 (Aplysia AKv3.1) nach Bixby et al. (1999) ausgingen. Anhand von Sequenzvergleichen wurden mögliche Interface-Residuen identifiziert. Abhängig vom Konservierungsgrad wurde zunächst theoretisch die Relevanz dieser Aminosäuren für die Interaktion eingeschätzt. Im dreidimensionalen Modell erfolgte computergestützt die Überprüfung dieser Aminosäuren. Aufgrund dieser Strukturanalyse wurden vier Residuen ausgewählt, die auf ihren Einfluss auf die Interaktion zwischen hKv2.1 und hKv6.2 überprüft wurden, und zwar in hKv2.1 Histidin 88, Glycin 90, Threonin 93 und Glutamin 97. Dem entsprechen in hKv6.2 Serin 74, Cystein 76, Arginin 79 und Alanin 83. Diese wurden über Punktmutationen in verschiedenen Kombinationen in Konstrukte eingeführt, die im Hefe-Zwei-Hybrid-System auf ihre Bindungsfähigkeit überprüft wurden. Dabei wurden reziproke Konstrukte verwendet, bei denen entweder ein Funktionsverlust oder eine Funktionsgewinn erwartet wurde. In keinem Fall konnte diese Vermutung bestätigt werden. Somit konnte keiner dieser Aminosäuren eine entscheidende Rolle in der Interaktion der Untereinheiten zugeschrieben werden. Abschließend konnte nachgewiesen werden, dass die gesamte T1A,B-Domäne aus hKv2.1 für eine Interaktion erforderlich ist. Eine genauere Eingrenzung auf ein spezifisches Motiv ist damit nicht gelungen.