NMR-spektroskopische Untersuchungen von Protein-Ligand-Interaktionen und zeitaufgelöste, NMR-spektroskopische Untersuchungen enzymatischer Reaktionen mit Progresskurvenanalytik

Abstract

Histone stellen einen wichtigen Baustein zur Packung der DNA dar. Durch Modifikationen der Seitenketten verschiedener Aminosäuren wird die Packung der DNA kontrolliert. Die Methylierung des Lysin-20 des Histons 4 durch die Methyltransferase Set8 ist einer dieser Mechanismen und spielt für die fehlerfreie Zellteilung eine wichtige Rolle. Die Untersuchung der enzymatischen Methylierung mehrerer kurzer Ausschnitte des Histons 4 zeigte, dass alle Peptide mit dem minimalen Bindungsmotiv umgesetzt wurden. Es konnte lediglich eine Verlangsamung mit steigender Kettenlänge beobachtet werden. Alle Ergebnisse konnten jeweils anhand einer einzigen Reaktionsverfolgung durch NMR-Spektroskopie und Progresskurvenanalytik mittels der Lösung der integrierten Form der Michaelis-Menten-Gleichung, welche die Lambert-W-Funktion nutzt, ermittelt werden. So wurde für das Peptid RHRKVL ein K’M = 261 ± 12 µM, für das Peptid RHRKVLRD ein K’M = 329 ± 23 µM und für das Peptid AKRHRKVLRD ein K’M = 523 ± 250 µM bestimmt. Ferner konnte mit dem Peptid RHRAVL, bei dem das zu methylierende Lysin durch ein Alanin ersetzt wurde, eine erfolgreiche Inhibition durchgeführt werden. Es wurde eine Inhibitionskonstante von KI = 58 µM für die Umsetzung des sehr ähnlichen Peptids RHRKVL bestimmt. Die Fucosyltransferase 2 (FUT2) ist an der Bildung verschiedener Oligosaccharide beteiligt. Dazu gehören auch Oligosaccharide mit den Lewismotiven Ley und sLey, welche eine wichtige Rolle im Leucozytenkreislauf und bei der Wechselwirkung von Zellen mit Krankheitserregern spielen. Überexpression von sLex, sLey und anderen fucosylierten Glykanen wird bei Entzündungen und im Verlauf verschiedener Krebserkrankungen beobachtet. Aus diesen Beobachtungen ergibt sich, dass FUT2 ein mögliches Ziel für therapeutische Ansätze sein kann. Zum Zeitpunkt dieser Arbeit waren keine Strukturdaten für FUT2 bekannt. Auf Grundlage von Homologiemodellen wurde eine mögliche Struktur und der Interaktion mit den natürlichen Substraten GDP-Fucose und LacNAc für FUT2 in silico erstellt. Dies ist ein möglicher Ansatz für weitere Studien und strukturbasiertes Design für mögliche Inhibitoren. Ferner wurden mittels zeitaufgelöster NMR-Spektroskopie und anschließender Progresskurvenanalyse die kinetischen Parameter KM’Akzeptor = 613 ± 121 μM und vmax’ = 1.7 ± 0.4 nM/s der natürlichen Substrate von FUT2 ermittelt. Neuraminsäurehaltige Glykane sind an verschiedenen molekularen Interaktionen wie Zell-Zell-Adhäsion, Befruchtung, Blutgerinnung sowie Immunreaktionen beteiligt. Sialyltransferasen katalysieren beim Aufbau der komplexen Glykane die Übertragung des Sialylrestes von Cytidin-5‘-monophosphat-Neuraminsäure auf einen Kohlenhydratakzeptor. Die Sialyltransferasen unterscheiden sich dabei in der Selektivität des Akzeptors und der katalysierten Verknüpfung. ST6Gal I katalysiert eine Verknüpfung des Sialylrestes an die 6-OH-Gruppe einer endständigen Galaktose. Die Bindung der Substrate an ST6Gal I wurden mittels STD-NMR-Experimenten untersucht. Es konnte für das Akzeptorsubstrat N-Acetyllactosamin eine Dissoziationskonstante von KD = 577 ± 188 µM ermittelt werden. Für das Donorsubstart Cytidin-5‘-monophosphat-Neuraminsäure wurde eine Dissoziationskonstante von KD = 4.9 ± 0.5µM ermittelt. Ferner wurde für das Donorsubstrat anhand der Intensität der STD-Signale ein Bindungsepitop erstellt. Kinetische Untersuchungen des enzymatischen Transfers der Sialylgruppe auf N Acetyllactosamin wurden mittels zeitaufgelöster NMR-Spektroskopie und anschließender Progresskurvenanalytik unter Verwendung der integrierten Lösung der Michaelis-Menten-Gleichung mit der Lambert-W-Funktion durchgeführt. Es konnte eine apparente Michaelis-Menten-Konstante von K‘M,CMP-5NeuAc = 333 ± 5 μM ermittelt werden. Lektin-Kohlenhydrat-Interaktionen spielen bei diversen biologischen Prozessen eine Rolle und sind deshalb auch von großer Interesse für die Entwicklung von Wirkstoffen. Multivalente Kohlenhydratstrukturen sind bereits regelmäßig zur Untersuchung dieser Interaktionen eingesetzt worden. Adamantan bietet ein gutes Gerüst für ein trimeres Kohlenhydratkonjugat mit der Möglichkeit einer vierten, unabhängigen Funktionalisierung. Es wurden Mannosekonjugate mit unterschiedlich langen Ethylenspacern untersucht. Mittels STD-NMR-Spektroskopie konnte ein KD,sol = 280 ± 47 µM für ein Konjugat mit einfacher und KD,sol = 177 ± 56 µM mit dreifacher Spacerlänge bestimmt werden, welche nur etwas besser als der des vergleichbaren Mannosemonomers war. Durch Funktionalisierung der vierten Adamantanecke mit einem Fluoreszenzfarbstoff konnte mittels eines Oberflächenfloureszenzessays ein KD,surf = 9.04 ± 6.41 µM für das Trimer mit einfacher Spacerlänge und KD,surf = 0.51 ± 0.23 µM für das Trimer mit dreifacher Spacerlänge bestimmt werden. Diese liegen deutlich unter dem vergleichbaren Monomer und zeigen das Potential von funktionalisiertem Adamantan als multivalentem Binder für Oberflächenproteine.