From MHC characterization to screening approaches

Abstract

An essential element of adaptive immunity is the selective binding of peptide antigens by major histocompatibility complex class I (MHC-I) proteins. They present antigenic peptides to cytotoxic T cells at the plasma membrane of mammalian cells. MHC-I is a heterodimer consisting of the strongly conserved beta-2-microglobulin light chain (β2m) and the heavy chain (HC), which has a highly variable region that forms a cleft to accommodate a peptide. As the peptide dissociates, the two noncovalently bound subunits fall apart. The resulting peptide-free state of MHC-I is not well understood, but it is known that free heavy chains (FHCs) can assemble in the plasma membrane to form homotypic complexes that perform various regulatory functions. In this work, the stoichiometry and dynamics of FHC assembly of murine MHC-I H-2Kb were investigated using native mass spectrometry (MS) and complementary methods (Chapter 3.1). The FHCs were found to form noncovalently bound dimers. Dimerization was shown to be mediated by the α3 domain binding the α3 domain of another FHC in a manner similar to binding the β2m subunit. The dynamics and structure of the peptide-free but natively assembled complex are of particular interest for understanding peptide-binding and -exchange processes. For this work, a disulfide-stabilized version of the human MHC-I molecule HLA-A*02:01 (dsA2) was thoroughly characterized by native MS and various supporting structural biological methods (Chapter 3.2). The dsA2 molecule was designed to be stable in the absence of peptides. Successful refolding of the heterogeneous protein complex was verified, and the dipeptide used for refolding was not detected either free or bound to dsA2 after removing it via buffer exchange (BEX). In striking contrast, only a minimal amount of folded wild type A2 (wtA2) was detected in the absence of dipeptide; however, wtA2 remained stable when dipeptide was present at millimolar concentrations. It was concluded that wtA2 is dependent on high concentrations of dipeptide to maintain its folded conformation, whereas dsA2 is conformationally and thermally stable in the absence of dipeptide. Nevertheless, dsA2 was still able to specifically bind or exchange peptides. Dipeptides were found to settle only in the A pocket or in both the A and F pockets. High-affinity nonapeptides were able to bind even at substoichiometric concentrations. The amino acid side chains lining the binding pockets switched in a coordinated manner between a peptide-free, unlocked state, and a peptide-bound, locked state. Peptide binding to the empty dsA2 molecule was studied in detail, and because of its unique stability, it was possible to determine the binding affinities of complexes loaded with various peptides, including truncated or reduced-charge peptides (Chapter 3.3). It was found that the two already known anchor positions could be stabilized independently. Further investigation revealed the contribution of additional amino acid positions to the binding strength. In addition, it was observed that dsA2 could bind a variety of peptides from a mixture. From the relative ratio of the different signals of MHC-peptide complexes, the affinities of the peptides could be estimated directly and simultaneously (Chapter 3.4). It became clear that the 13+ charge state is the one least affected by dissociation processes and is therefore suitable for direct read-out of the relative affinity. Various parameters related to the mass spectrometer and the sample were optimized to screen peptides. For example, it was determined that the total peptide concentration should be lower than that of MHC-I to eliminate time-dependent competition effects. Native MS analysis of MHC-I molecules is presented as a versatile tool for peptide screening approaches. As a complement to computational prediction tools, the method presented in this work rapidly and efficiently estimates the binding strength of even peptides with low affinity for MHC-I complexes. It has enormous potential for eliminating binding affinity biases and thus accelerating drug discovery in infectious diseases, autoimmunity, vaccine development, and cancer immunotherapy.

Ein wesentliches Element der adaptiven Immunität ist die selektive Bindung von Peptidantigenen durch Proteine des Haupthistokompatibilitätskomplexes Klasse I (MHC-I). An der Plasmamembran von Säugetierzellen präsentieren diese den zytotoxischen T-Zellen antigenische Peptide. MHC-I ist ein Heterodimer, das aus der hochkonservierten leichten Beta-2-Mikroglobulin-Kette (β2m) und der schweren Kette besteht. Letztere weist einen hochvariablen Bereich auf, der eine Tasche zur Aufnahme eines Peptids bildet. Wenn das Peptid dissoziiert, fallen die beiden nicht kovalent gebundenen Untereinheiten auseinander. Der daraus resultierende peptidfreie Zustand von MHC-I ist nicht gut untersucht, es ist jedoch bekannt, dass sich die freien schwere Ketten (FHCs) in der Plasmamembran zu homotypischen Komplexen zusammenfinden können, die dann verschiedene regulatorische Funktionen erfüllen. In dieser Arbeit wurden die Stöchiometrie und die Dynamik der FHC-Assemblierung des murinen MHC-I H-2Kb mit nativer Massenspektrometrie (MS) und ergänzenden Methoden untersucht (Kapitel 3.1). Es wurde festgestellt, dass die FHCs nichtkovalent gebundene Dimere bilden. Es konnte gezeigt werden, dass die Dimerisierung durch die Bindung der α3-Domäne an die α3-Domäne eines anderen FHC erfolgt – auf ähnliche Weise wie bei der Bindung zu β2m. Die Dynamik und Struktur des peptidfreien, aber nativ assemblierten Komplexes sind von besonderem Interesse für das Verständnis von Peptidbindungs- und -austauschprozessen. Für diese Arbeit wurde eine Disulfid-stabilisierte Version des menschlichen MHC-I-Moleküls HLA-A*02:01 (dsA2) durch native MS und verschiedene unterstützende strukturbiologische Methoden gründlich charakterisiert (Kapitel 3.2). Das dsA2-Molekül wurde so konzipiert, dass es in Abwesenheit von Peptiden stabil ist. Die erfolgreiche Rückfaltung des heterogenen Proteinkomplexes wurde verifiziert und das zur Rückfaltung verwendete Dipeptid wurde weder frei noch gebunden an dsA2 nachgewiesen, nachdem es mittels Pufferaustausch (BEX) entfernt wurde. In auffälligem Kontrast dazu wurde in Abwesenheit des Dipeptids nur eine minimale Menge an gefaltetem Wildtyp-A2 (wtA2) nachgewiesen; wtA2 blieb jedoch stabil, wenn das Dipeptid in millimolaren Konzentrationen vorhanden war. Daraus wurde gefolgert, dass wtA2 auf hohe Konzentrationen von Dipeptid angewiesen ist, um seine gefaltete Konformation aufrechtzuerhalten, während dsA2 in Abwesenheit von Dipeptid konformationell und thermisch stabil ist. Dennoch war dsA2 immer noch in der Lage, Peptide spezifisch zu binden oder auszutauschen. Es wurde festgestellt, dass Dipeptide nur in der A-Bindungstasche oder sowohl in der A- als auch in der F-Bindungstasche gebunden waren. Hochaffine Nonapeptide konnten sogar in substöchiometrischen Konzentrationen binden. Die Aminosäureseitenketten, die die Bindungstaschen auskleiden, wechselten in koordinierter Weise zwischen einem peptidfreien, nicht geschlossenen Zustand und einem peptidgebundenen, geschlossenen Zustand. Die Peptidbindung an das leere dsA2-Molekül wurde eingehend untersucht und aufgrund seiner einzigartigen Stabilität war es möglich, die Bindungsaffinitäten von Komplexen zu bestimmen, die mit verschiedenen Peptiden beladen waren, einschließlich verkürzter oder ladungsreduzierter Peptide (Kapitel 3.3). Es wurde festgestellt, dass die beiden bereits bekannten Ankerpositionen unabhängig voneinander stabilisiert werden können. Weitere Untersuchungen ergaben, dass zusätzliche Aminosäurepositionen zur Bindungsstärke beitragen. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass dsA2 eine Vielzahl von Peptiden aus einem Gemisch binden kann. Aus dem relativen Verhältnis der Signale der verschiedenen MHC-Peptid-Komplexe konnten die Affinitäten der Peptide direkt und simultan abgeschätzt werden (Kapitel 3.4). Es zeigte sich, dass der 13+-Ladungszustand am wenigsten von Dissoziationsprozessen betroffen ist und sich daher für das direkte Ablesen der relativen Affinität eignet. Verschiedene Parameter in Bezug auf das Massenspektrometer und die Probe wurden für das Screenen von Peptiden optimiert. So wurde beispielsweise festgestellt, dass die Gesamtpeptidkonzentration niedriger sein sollte als die von MHC-I, um zeitabhängige kompetitive Effekte auszuschließen. Die native MS-Analyse von MHC-I-Molekülen wird als vielseitiges Instrument für Peptidscreening-Ansätze vorgestellt. Als Ergänzung zu computergestützten Vorhersagemethoden lassen sich mit der in dieser Arbeit vorgestellte Methode schnell und effizient die Bindungsstärke selbst von Peptiden mit geringer Affinität für MHC-I-Komplexe bestimmen. Die Technik hat ein enormes Potenzial zur Beseitigung von Verzerrungen bei der Ermittlung von Bindungsaffinität und damit zur Beschleunigung der Arzneimittelentdeckung in Hinblick auf Infektionskrankheiten, Autoimmunität, sowie der Impfstoffentwicklung und Krebsimmuntherapie.