Analysis of T cell development in the human thymus by multicolour flow cytometry

Abstract

Introduction: The thymus provides the microenvironment for T cell development and enables the generation of a broad repertoire of functional and self-tolerant T cells. We hypothesise that impairment of thymic function during early life increases the risk of developing immune-mediated disorders later in life. The aim of this thesis is to establish a flow cytometry panel that allows a comprehensive ex vivo and in vitro assessment of T cell development in different health conditions and under exposure to exogenous insults such as medication. Methods: We designed a multicolour flow cytometry panel that allows us to phenotype the stages of T cell development on the basis of surface marker expression. The panel was thoroughly optimized, including titration, compensation and the comparison of a variety of fluorochrome-conjugated antibody combinations. We used the panel to investigate the effects of glucocorticoids (GCs) on developing thymocytes. For this, we used an in vitro assay to determine the sensitivity of the different human thymocyte populations to betamethasone, and the OP9 coculture system to model T cell development in vitro and analyse how GCs affect the dynamics of lymphopoiesis. Second, we immune phenotyped the thymi of 44 infants with CHD and compared the “thymocyte signatures” among age groups and different types of CHD. Results: With the established panel we have identified the major stages of human T cell development, from early progenitors to mature T cells ready to egress the thymus. We observed that in vitro betamethasone exposure induced apoptosis in thymocytes, mainly affecting the immature CD4 single-positive CD34-positive (ISP4 CD34+) and the double-positive (DP) population, leading to a relative increase of T regulatory, CD4 and CD8 single-positive (SP) cells. Furthermore, GCs caused a delayed thymocyte development in the OP9 coculture system. Children with CHD had higher cortisol levels than healthy controls, so their thymocyte composition is most likely influenced by endogenous GC exposure. We found a specific thymocyte signature in the most severe CHD groups (transposition of the great arteries and a group summarised as “left hypoplasia”) with decreased DP frequencies and concomitantly increased CD4 SP frequencies. Additionally, we found correlations between reduced DP frequencies and young age (< 1 month) and elevated cardiac biomarkers, respectively. Conclusion: The established panel proved to be a reliable tool to analyse T cell development ex vivo and in vitro. We have acquired valuable knowledge on the effects of GCs on specific thymocyte subpopulations with data from in vitro modelling of T cell development. Finally, our ex vivo data suggest a possible influence of CHD on T cell development and indicate that CHD itself might cause immune alterations.

Einleitung: Der Thymus ist ein spezialisiertes lymphatisches Gewebe und dient als Entwicklungsnische für T-Zellen. Diese durchlaufen eine Reihe von Selektionsprozessen und bilden schließlich ein umfangreiches, selbsttolerantes Repertoire. Wir nehmen an, dass Störungen der T-Zell-Entwicklung im Thymus während der frühkindlichen Entwicklung zu immunologischen Erkrankungen führen können. Das Ziel dieser Dissertationsarbeit ist es, ein Panel zur differenzierten durchflusszytometrischen Analyse von Thymozyten zu entwickeln. Dieses soll neue Einblicke in die T-Zell-Entwicklung bei verschiedenen Erkrankungen und unter äußeren Einflussfaktoren, wie bspw. Medikation, ermöglichen. Methoden: Wir entwickelten und optimierten ein FACS-Panel zur Phänotypisierung von Thymozyten anhand der Expression verschiedener Oberflächenmarker. Mithilfe dieses Panels untersuchten wir zunächst den Effekt von Glukokortikoiden auf sich entwickelnde Thymozyten. Hierfür nutzen wir ein in vitro-Assay, um die Glukokortikoidsensitivität der unterschiedlichen Thymozyten-Populationen zu ermitteln, sowie die OP9-Kokultur als in vitro-Modell für T-Zell-Entwicklung, um den Effekt von Glukokortikoiden auf die Entwicklungsdynamik der Thymozyten zu analysieren. Zusätzlich immunophänotypisierten wir die Thymi von 44 Kleinkindern (Alter <1 Jahr) mit angeborenen Herzfehlern und verglichen die Immunsignaturen zwischen den Altersgruppen und zwischen den verschiedenen Arten von Herzfehlern. Ergebnisse: Mithilfe des neu entwickelten Panels konnten die wesentlichen Thymozyten-Subpopulationen definiert werden, von frühen Vorläuferzellen bis zu vollständig gereiften, einfach-positiven T-Zellen, die in die Peripherie migrieren können. Wir beobachteten, dass Betamethasonexposition in vitro Apoptose in insbesondere den CD4-positiven CD34-positiven sowie den CD4-CD8-doppelt-positiven Thymozyten auslöste und es hierdurch zu einem relativen Anstieg der CD4- und CD8-einfach-positiven Thymozytenpopulationen kam. In der OP9-Kokultur kam es nach Betamethasonexposition zu einer Entwicklungsverzögerung der Thymozyten. Da wir zeigen konnten, dass Kinder mit angeborenen Herzfehlern im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöhte Kortisolwerte aufweisen, gehen wir davon aus, dass deren Thymozytenentwicklung durch die endogen erhöhten Kortisolwerte beeinflusst wird. In den Gruppen mit den schwersten Herzfehlern (Transposition der großen Arterien und Hypoplastisches Linksherzsyndrom/ Aortenstenose/ Unterbrochener Aortenbogen) zeigte sich eine veränderte Komposition der Thymozytenpopulationen mit einer prozentual verminderten doppelt-positiven Population und einem kompensatorisch erhöhten Anteil an CD4-einfach-positiven Thymozyten. Zudem fanden wir Korrelationen zwischen einer verminderten doppelt-positiven Population und jungem Alter (< 1 Monat) bzw. erhöhten kardialen Markern wie Troponin T und NT-proBNP. Schlussfolgerung: Das etablierte Panel konnte verlässlich zur Analyse der T-Zell-Entwicklung ex vivo und in vitro eingesetzt werden und mithilfe des Panels konnten wir bereits vorbestehendes Wissen über den Einfluss von Glukokortikoiden auf Thymozyten mit Daten zur Entwicklungsdynamik erweitern. Des Weiteren lassen unsere ex vivo Daten einen möglichen Einfluss von angeborenen Herzfehlern auf die Zusammensetzung der Thymozytenpopulationen erkennen und weisen darauf hin, dass angeborene Herzfehler zu Veränderungen des Immunsystem führen können.