Food Profiling - Molekularbiologische Methoden zur Differenzierung von Walnusssorten (Juglans regia)

Abstract

Im Zuge dieser Forschungsarbeit sollte zur Authentizitätsbestimmung von 12 Sorten der Spezies Juglans regia molekularbiologische Methoden entwickelt werden, die entweder sequenzbasiert waren oder auf non-targeted Strategien beruhten. Da der Same aus dem maternalen Erbgut der Mutter (der ortsdefinierte Walnussbaum) und dem paternalen Erbgut des Pollens (Vater, von verschiedenen anderen, variablen Walnussbäumen) gebildet wird, lässt sich auf Basis der darin enthaltenen Kern-DNA keine Sortendifferenzierung abbilden. Als Alternative wurden rein maternales Gewebe bzw. ausschließlich von der Mutter stammende DNA ausgewählt. Hierzu zählen Blätter, das Perikarp sowie die Chloroplasten und ihre darin enthaltene plastidäre DNA.

Zu Beginn wurden DNA-Isolierungsmethoden entwickelt, um eine angemessene DNA-Qualität und -Quantität zu ermöglichen. Hierbei wurde erfolgreich für das Blatt- und Perikarpmaterial eine DNA-Isolierungsmethode etabliert. Auch eine Anreicherung der Chloroplasten und damit einhergehend eine Erhöhung der plastidären DNA-Konzentration im Vergleich zur ebenfalls vorhandenen Kern-DNA wurde im Zuge der Methodenentwicklung versucht. Hierfür wurden unterschiedliche isopyknische Zentrifugationen und Gradienten, bspw. ein Cäsiumchlorid-Gradient zur Aufreinigung der plastidären DNA aus den Chloroplasten, getestet. Die gewählten Verfahren waren allerdings für die vorliegende Problemstellung zu ineffizient, d.h. eine Anreicherung der Chloroplasten und damit der plastidären DNA konnte damit nicht erzielt werden. Am Ende des Optimierungsprozesses konnte jedoch für eine Sequenzierung qualitativ und quantitativ geeignete plastidäre DNA isoliert werden. Aus den mittels NGS erhaltenen Datensätzen konnten die vollständigen Plastidengenome von insgesamt 12 unterschiedlichen Walnussorten assembliert werden. Überraschenderweise wiesen alle untersuchten Genome mit einer Länge von ca. 160 kbp die identische Sequenz auf, was auf ein sehr enges Verwandtschaftsverhältnis zurückzuführen ist. Erklärbar ist dieser Befund dadurch, dass alle untersuchten Sorten offensichtlich von einem gemeinsamen Vorläufer abstammen. Nachdem eine Differenzierung von nahverwandten Sorten auf Basis der Plastidengenome nicht möglich ist und damit auch eine Sortendifferenzierung bei ausschließlichem Vorliegen der Walnusskerne (da biparental) ausscheidet, konzentrierte sich die weitere Arbeit auf Walnüsse, die in der Schale vermarktet werden. Im Fall der Walnuss stammt die Schale ursprünglich aus dem Blütengewebe, welches einen diploiden Chromosomensatz ausschließlich der Mutter enthält. In diesem Fall kann das Kerngenom zur Unterscheidung von Walnuss-Sorten herangezogen werden. Es wurden vier Genabschnitten des maternalen, nukleären Genoms sequenziert, verglichen und Unterschiede (SNPs) identifiziert. Daraus resultierten sequenzbasierte Methoden, in Form einer ARMS- und RFLP-PCR. Ebenso wurden non-targeted Fingerprinting-Strategien entwickelt, wozu die Mikrosatelliten-Analyse und die RAPD-PCR gehörten. Dadurch stehen der Routineanalytik mehrere Methoden zur Sortendifferenzierung von Walnüssen in der Schale zur Verfügung.

The present research work includes molecular biological methods, which were developed to determine the authenticity of 12 varieties of the species Juglans regia, which were sequence-based or non-targeted strategies. Since the seed is formed from the maternal genome of the mother (the location-defined walnut tree) and the paternal genome of the pollen (father, from various other variable walnut trees), no variety differentiation can be done based on the nuclear DNA it contains. As an alternative, pure maternal tissue or DNA derived exclusively from the mother was selected. These include leaves, the pericarp, and the chloroplasts and their plastidary DNA contained therein.

At the beginning, appropriate DNA isolation methods had to be developed to allow adequate DNA quality and quantity. Furthermore, a chloroplast enrichment and associated increase in plastidary DNA concentration relative to the also present nuclear DNA was attempt during method development. For this purpose, different isopycnical centrifugations and gradients, e.g. a cesium chloride gradient for the purification of plastidary DNA from chloroplasts, were tested. However, the chosen methods were inefficient for the problem at hand, i.e. enrichment of chloroplasts and their plastidary DNA could not be achieved with them. However, at the end of the optimization process, plastidary DNA suitable for sequencing could be isolated qualitatively and quantitatively. From the datasets obtained by NGS, the complete plastid genomes of a total of 12 different walnut cultivars could be assembled. Surprisingly, all the studied genomes had the identical sequence with a length of about 160 kbp, which can be attributed to a very close relationship. This finding can be explained by the fact that all the studied varieties obviously descended from a common ancestor. Since a differentiation of closely related cultivars based on plastid genomes is not possible and thus a cultivar differentiation in the exclusive walnut kernels (since biparental) is ruled out, further work focused on walnuts market in the shell. In the case of the walnut, the shell originates from the floral tissue, which contains a diploid set of chromosomes exclusively from the mother. Therefore, the nuclear genome can be used to differentiate walnut varieties. Four gene segments of the maternal, nuclear genome were sequenced, compared and differences (SNPs) identified. This resulted in sequence-based methods, in the form of ARMS- and RFLP-PCR.

Non-targeted fingerprinting strategies were also developed, including microsatellite analysis and RAPD-PCR. This allows the routine analysis to use several methods for variety differentiation and authentication for walnuts in the shell.