Super-resolved and live visualization of Yersinia type three secretion system components

Abstract

Yersinia enterocolitica besitzt ein Typ 3 Sekretionssystem (T3SS) um Effektorproteine in Wirtszellen zu injizieren. Diese komplexe makromolekulare Nanomaschine hat Abmessungen von etwa 120 nm Länge und bis zu 30 nm Breite. Um die Komponenten des T3SS voneinander aufgelöst sichtbar zu machen, ist hochauflösende (Live-) Fluoreszenzmikroskopie die bevorzugte Technologie. Bislang gibt es jedoch nur wenige veröffentlichte Studien, in denen hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung des T3SS eingesetzt wurde. Darüber hinaus haben die etablierten hochauflösenden Mikroskopietechniken STED und STORM nicht genügend Auflösungsvermögen, um einzelne T3SS-Komponenten oder sogar Proteine aufzulösen. In dieser Arbeit wurde die kürzlich eingeführte MINFLUX-Mikroskopie verwendet, die eine Auflösung und Lokalisierungspräzision bis in den einstelligen Nanometerbereich erreicht, um verschiedene T3SS-Komponenten in situ, d. h. in Kontakt mit infizierten Zellen, sichtbar zu machen. MINFLUX in Kombination mit einer Nanobody-Färbung eines markierten Proteins der T3SS Translokationspore ermöglichte zum ersten Mal die Visualisierung von Translokationsporen bis auf Einzelmolekülebene. Diese Daten zeigten, dass die Größe der T3SS-Translokationspore von Y. enterocolitica etwa 18 nm beträgt. Darüber hinaus wurde ein Proteinkomplex der T3SS „sorting platform“, der aus einer einzigen Komponente besteht, in seiner tatsächlichen Größe innerhalb eines ganzen Bakteriums sichtbar gemacht. Hierfür wurde 3D-MINFLUX etabliert, die isotrope Lokalisierungsgenauigkeiten im einstelligen Nanometerbereich erreichte. Es zeigte sich, dass die Mehrzahl der „sorting platforms“ in der Peripherie des Bakteriums lokalisiert ist. Darüber hinaus wurde 2-Farben-MINFLUX-Mikroskopie verwendet, um eine „sorting platform“ und ein Protein der Translokationspore im selben T3SS darzustellen. Zusätzlich wurden 2D- und 3D-STED-Mikroskopie in lebenden Zellen eingesetzt, um einzelne Translokationsporen über einen langen Zeitraum zu visualisieren. Insgesamt lieferte diese Arbeit neue Erkenntnisse über die Organisation und Verteilung der Translokationspore und der „sorting platform“ im T3SS von Y. enterocolitica. Die neue MINFLUX-Technologie, die hier zum ersten Mal auf eine bakterielle molekulare Maschine angewandt wurde, wird nie dagewesene Möglichkeiten für die Darstellung molekularer Details und Dynamiken in Bakterien und Eukaryoten gleichermaßen bieten.

Yersinia enterocolitica harbors a type 3 secretion system (T3SS) to translocate effector proteins into host cells. This complicated macromolecular nanomachine has dimensions of approximately 120 nm length and up to 30 nm width. To visualize components of the T3SS and resolve them from each other, (live-) super-resolution fluorescence microscopy is the preferred tool. However, to date only a handful of studies have been published employing super-resolution fluorescence microscopy to gain insights into the T3SS. Furthermore, the established super-resolution microscopy techniques STED and STORM do not provide enough resolution to resolve single T3SS components or even proteins. In this work the recently introduced MINFLUX microscopy, which offers resolutions and localization precisions down to single-digit nanometers, was used to visualize various T3SS components in situ, i.e., in contact with infected cells. MINFLUX in combination with nanobody labeling of a tagged translocation pore protein enabled for the first time the visualization of translocation pores down to the single molecular level. The data indicated that the size of the Y. enterocolitica T3SS translocation pore is approximately 18 nm. Furthermore, a T3SS sorting platform complex formed by a single component was visualized at the actual size within a whole bacterium. For this, 3D-MINFLUX reaching isotropic localization precisions in the single digit nanometer range was established. It revealed that the majority of sorting platforms are localized in the periphery of the bacteria. In addition, 2 color MINFLUX microscopy was used to co-visualize a sorting platform and a translocation pore protein of the same T3SS. Finally, live cell 2D- and 3D-STED microscopy were used to visualize single translocation pores during a cell infection over a long time frame. Altogether this work provided new insights into the organization and distribution of the translocation pore and sorting platform in the Y. enterocolitica T3SS. The new MINFLUX technology, applied here for the first time to a bacterial molecular machine, will enable unprecedented opportunities for imaging molecular details and movements in bacteria end eukaryotes alike.