Regulation of cellular surface exposure of soluble MMPs in primary human macrophages

Abstract

Matrix-Metalloproteasen (MMPs) sind zinkabhängige Endopeptidasen, die vor allem Bestandteile der extrazellulären Matrix (EZM) wie Kollagene, Fibronektine und Laminine, aber auch für die Adhäsion verantwortliche Proteine wie Integrine oder auch andere MMPs proteolytisch spalten und damit ein entscheidender Faktor für die Fähigkeit primärer Makrophagen sind, sich abzulösen und durch verschiedene Gewebe zu wandern. MMPs, die insbesondere von primären Makrophagen produziert werden, die Teil des angeborenen Immunsystems sind, sind auch an der Regulation von pro- und antiinflammatorischen Prozessen beteiligt, indem sie durch ihre enzymatische Aktivität sowohl unter homöostatischen als auch unter pathogenen Bedingungen Zytokine und Chemokine freisetzen. Da die MMP-Familie 28 Mitglieder umfasst, die in Membran-Typ-MMPs (MT-MMPs) oder Kollagenasen, Stromelysinen, Gelatinasen und Matrilysinen und anderen unterteilt sind, die unterschiedliche strukturelle Eigenschaften aufweisen, haben sie nur wenige Domänen gemeinsam. Alle MMPs enthalten eine katalytische Domäne, die ein Zink-Ion bindet und für seine enzymatische Aktivität verantwortlich ist, ein Propeptid, das zur Aktivierung abgespalten werden muss, und eine Signalsequenz, die für den jeweiligen intrazellulären Transport benötigt wird. Mit Ausnahme von Matrilysinen oder Typ II-MT-MMPs teilen sich die meisten Untergruppen eine Hämopexin-Domäne, die für eine spezifischere Substraterkennung erforderlich ist. MT-MMPs sind zusätzlich entweder mit einer Transmembrandomäne (TM-Domäne) ausgestattet, die kovalent an der Plasmamembran verankert ist oder mit einer GPI-anchor Domäne, die nicht kovalent bindet. MMPs, denen eine TM-Domäne fehlt, werden als „soluble MMPs“ bezeichnet, die hauptsächlich in den extrazellulären Raum sezerniert werden, gelegentlich aber auch oberflächen-assoziiert an der Zellmembran zu finden sind. Das Ziel dieser Dissertation war es, die Regulation und den Transport von löslichen MMPs in primären humanen Makrophagen und ihre Rolle für deren Abbaufähigkeit aufzuklären. Es wird gezeigt, dass die Proteinexpressionsprofile von MMP7, -9 und -12 in Monozyten während der Differenzierung zu Makrophagen aber auch polarisationsabhängig sich verändern und in unterschiedlichen intrazellulären Vesikelpopulationen lokalisieren, die von MT1-MMP und untereinander unterscheidbar sind. Im Gegensatz zu MT1-MMP sind diese “soluble MMPs” nicht mit Podosomen, den wichtigsten adhäsiven und abbauenden Strukturen von Makrophagen, assoziiert. Des weiteren wird gezeigt, dass die Oberflächenexposition von MMP7 ein relevanter Faktor für die Abbaufähigkeit von Makrophagen ist und durch den ADP-Ribosylierungsfaktor 6 (ARF6) gesteuert wird, der ein wichtiger Endozytoseregulator ist. Es lässt sich zusammenfassen, dass lösliche MMPs eine inhomogene Gruppe sind, die zur Abbaufähigkeit von Makrophagen beitragen. Lösliche MMPs zeigen eine eigene intrazelluläre Lokalisation und werden daher selektiv transportiert und reguliert. Einige zeigen eine Korrelation mit dem Polarisationszustand von Makrophagen. Lösliche MMPs können ohne Transmembrandomäne oberflächen-assoziiert sein. Die oberflächen-assoziierte Population von MMP7 wird durch den Endozytoseregulator ARF6 gesteuert. Die mechanistische Verbindung zwischen MMP7 und ARF6 (einem mutmaßlichen Rezeptor) ist jedoch noch nicht identifiziert und muss weiter untersucht werden. Einige potenzielle Kandidaten sind Heparansulfat-Proteoglykane (HPSGs) oder „Low-Density-Lipoprotein-Rezeptor-related Proteins“ (LRPs), aber auch „Tissue-inhibitors of Metalloproteinases“ (TIMPs). Die Abhängigkeit der Protein Expression von „soluble MMPs“ von der pro- oder antiinflammatorischen Polarisation ist ein wichtiger Aspekt in Krankheiten, in dem sich diese von MT1-MMP - einem konstitutiv exprimierten MMP in Makrophagen - unterscheiden. Dies ermöglicht eine spezifischeres therapeutisches Targeting auf Regulationsmechanismen in Makrophagen und deren Rolle in verschiedenen Krankheiten, z.B. als tumorassoziierte Makrophagen (TAMs) für künftige Arbeiten.

Matrix Metalloproteases (MMPs) are zinc-dependent endopeptidases, which degrade mainly components of the extracellular matrix (ECM) such as collagens, fibronectins and laminins, but also proteins responsible for adhesion such as integrins or even other MMPs and are thus a crucial factor for the capability of primary macrophages to detach and migrate through various tissues. MMPs especially produced by primary macrophages, which are part of the innate immune system, are also involved in the regulation of pro- and anti-inflammatory processes by releasing cytokines and chemokines through their enzymatic activity in both homeostatic or pathogenic circumstances. Since The MMP-family contains 28 members, subgrouped in Membrane-type-MMPs (MT-MMPs) or collagenases, stromelysins, gelatinases and matrilysins and others, which show different structural properties, they have only a view domains in common. All MMPs contain a catalytic domain, endowed with a zinc-ion, which is responsible for its enzymatic activity, a propeptide, which must be cleaved off for activation and a signal sequence, which is important for the respective intracellular trafficking. Except for matrilysins or type II-MT-MMPs, most subgroups share a hemopexin-domain, which is required for a more specific substrate recognition. MT-MMPs are additionally endowed with either a transmembrane-domain (TM-domain) to be covalently anchored at the plasma membrane or a GPI-anchor domain for non-covalent binding. MMPs, which lack of a TM-domain, are called soluble MMPs, which are mainly secreted into the extracellular space, but are occasionally also surface-associated at the plasma membrane. The goal of this dissertation was to elucidate the regulation and trafficking of soluble MMPs in primary human macrophages and their role for the degradative capability of them. It is shown that MMP7, -9 and -12 change their protein expression profile in monocytes, differentiating into macrophages, also in a polarization-dependent manner and localize in distinct intracellular vesicle populations distinguishable from MT1-MMP and each other. In contrast to MT1-MMP, these soluble MMPs are not associated with podosomes, the main adhesive- and degradative structures of macrophages. The surface-exposure of MMP7 as pars pro toto for soluble MMPs is important for the degradative capability of macrophages and is regulated by ADP-ribosylation factor 6 (ARF6), which is an important endocytosis regulator. Summarized, soluble MMPs are an inhomogenous group, which contributes to the degradative capability of macrophages. Soluble MMPs show distinct intracellular localization and are thus selectively transported and regulated. Some show a correlation with the polarization state of macrophages. Soluble MMPs can be surface-associated without a transmembrane-domain. The surface-associated population of MMP7 is regulated by the endocytosis regulator ARF6. However, the mechanistic connection between MMP7 and ARF6 (a putative receptor) has not been identified, yet and needs further investigation. Some potential candidates are heparan-sulfate-proteoglycans (HPSGs) or low density lipoprotein receptor-related proteins (LRPs), but also tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMPs). The dependency on the pro-or anti-inflammatory polarization of their protein expressions is an important difference to MT1-MMP - a constitutively expressed MMP in macrophages - in pathogenic contexts. This offers a more specific therapeutic targeting of regulatory mechanisms in macrophages and their role in various diseases e.g. as tumour-associated macrophages (TAMs) as a future perspective.