Innovative Diagnostik und Therapie in der Frühphase des Schlaganfalls durch den Einsatz der Magnetpartikelbildgebung und P2X7-spezifischer Nanobodies

Abstract

Der Schlaganfall stellt statistisch mit 6,6 Mio. Toten und 12,2 Mio. Neuerkrankungen pro Jahr die zweithäufigste Todesursache und die dritthäufigste Ursache für Behinderungen weltweit dar (Collaborators, 2019; V. L. Feigin et al., 2022; Sacco et al., 2013). Zurzeit leben weltweit 101 Mio. Menschen mit den Folgen eines erlebten Schlaganfalls; eine von vier Personen über 25 Jahren erleidet in ihrem Leben einen Schlaganfall (Owolabi et al., 2022). Folgenschwer sind insbesondere arterielle Schlaganfälle, die im Fokus dieser Arbeit stehen. Klinisch äußern sich arterielle Schlaganfälle vor allem durch einen plötzlichen Verlust der neurologischen Funktion von Hirn, Retina oder des Rückenmarks aufgrund einer Ischämie oder einer intrazerebralen Blutung (99 %) (Benjamin et al., 2019; Zerna, Thomalla, Campbell, Rha, & Hill, 2018). Seltener (1 %, v.a. in der Perinatalphase) und auch weniger akut kann ein venöses Geschehen infolge einer zentralen Venenthrombose Ursache der neurologischen Funktionsstörung sein (Dunbar & Kirton, 2019; Pare & Kahn, 2012). Dies wird in vorliegender Arbeit nicht weiter in den Blick genommen. Arterielle Schlaganfallsyndrome zeichnen sich vor allem durch ihr plötzliches Auftreten ab. Sie lassen sich in eine ischämische und eine hämorrhagische Entität unterscheiden. Heutzutage stellen sich zwei konkrete Hauptfragen in der Schlaganfallbehandlung. Einerseits fehlen Bildgebungen, um Ischämien und Blutungen in Echtzeit zu detektieren und deren Verlauf ebenso zu beobachten. Des Weiteren ist der Pathomechanismus bisher noch nicht vollkommen verstanden. Ein genaueres Verständnis des Pathomechanismus ermöglicht eine zielgerichtete Therapie des Schlaganfalls und seiner Folgen. Diese Hauptfragen stellten für mich die Basis meiner Forschungsthemen dar. Mit 10 – 15 % stellt die intrazerebrale Blutung (ICB) nicht die häufigste Schlaganfallentität dar, jedoch ist sie mit einer extrem hohen Morbidität und Mortalitätsrate sowie einer schlechteren Prognose als ihr ischämisches Analogon verbunden (Valery L. Feigin, Lawes, Bennett, Barker-Collo, & Parag, 2009; Weimar & Kleine-Borgmann, 2017). Sowohl für die ischämische Entität als auch für die ICB sind vertrauenswürdige und praktische Methoden zum kontinuierlichen, nicht-invasiven Monitoring der zerebralen Perfusion und des intrakraniellen Hämatoms notwendig. Im Jahr 2017 konnten in diesem Zusammenhang Ludewig et al. zeigen, dass bei einem ischämischen Schlaganfall eine qualitativ mit dem MRT vergleichbare Echtzeit- Darstellung des Perfusionsdefizits mittels Magnetpartikelbildgebung (MPI) möglich ist, und somit die MPI als potentielle moderne Bildgebung aufführen (Ludewig et al., 2017). Die MPI ist ein strahlungsfreies tomographisches Bildgebungsverfahren, welches superpara-magnetische Eisenoxidpartikel (SPIOs) nutzt, um dreidimensionale volumetrische Bilder mit einer hohen zeitlichen Auflösung darzustellen (Gleich & Weizenecker, 2005). Bis jetzt unklar ist jedoch, ob mithilfe des MPIs auch eine Echtzeit-Darstellung einer ICB möglich ist. Um eine adäquate Darstellung der Blutung im MPI zu ermöglichen, müssen sich die SPIOs in der Blutung anreichern. Diesem Thema habe ich einen Teil meiner Doktorarbeit gewidmet. Folgend auf die experimentelle Induktion einer intrazerebralen Blutung im murinen Modell erfolgte die intravenöse Applikation von SPIOs, woraufhin die entstehende Blutung in der MPI nachvollzogen wurde.

Mit 62 % stellt die arterielle Ischämie den größten Anteil der arteriellen Schlaganfallsyndrome dar (V. L. Feigin et al., 2022). Wie schon vorher angeführt, ist leider bis heute die vollständige Pathophysiologie des Schlaganfalls nicht ganzheitlich verstanden. Die Folgen eines ischämischen Schlaganfalls stellen sich nach heutigem Stand wie folgt dar. Pathophysiologisch führt die fokale Beeinträchtigung der Hirndurchblutung zu einer mangelnden Zufuhr von für die Hirnzellen überlebenswichtigen Substraten wie Sauerstoff und Glukose und somit zu einer Beeinträchtigung der Aufrechterhaltung der Zellhomöostase und ihres Ionengradienten (Martin, Lloyd, & Cowan, 1994). In der Folge kommt es zu einem Zusammenbruch des Ionengradienten mit Depolarisierung von insbesondere Neuronen und Gliazellen mit anschließender Freisetzung von exzitatorischen Aminosäuren wie Glutamat, welches eine Depolarisation umgebender Zellen wieder neu initiiert (Dirnagl, Iadecola, & Moskowitz, 1999; Katsura, Kristian, & Siesjo, 1994). Die daraus resultierende Exzitationswelle verursacht durch die Aktivierung von proteolytischen Enzymen und einer erhöhten Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) eine Schädigung von intra- und extrazellulären Strukturen (Huang, Upadhyay, & Tamargo, 2006; Orellana-Urzua, Rojas, Libano, & Rodrigo, 2020). Diese initiale Schädigung des hypoxischen Gewebes stellt den Beginn einer sterilen Entzündung dar, welche die ursprüngliche Hirnschädigung und die neurologische Funktionsfähigkeit negativ beeinflusst (Dirnagl et al., 1999; Huang et al., 2006). In diesem hypoxischen Gewebe werden folgend zahlreiche Mediatoren freigesetzt, die Zellen wie Mikroglia des umliegenden Gewebes aktivieren und zur Infiltration anderer Immunzellen wie neutrophiler Granulozyten führen (Jones et al., 2018). Zu jenen Mediatoren gehören vor allem Adenosintriphosphat (ATP) sowie Nicotinamodadeninnucleotid (NAD), Hitzeschockproteine (HSP) und das High-Mobility-Group-Box-1-Protein (HMGB1). Durch die Bindung an spezifische Rezeptoren von Zellen des angeborenen Immunsystems können diese Faktoren eine Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen auslösen, welche die Entzündungskaskade im Weiteren verstärken (Broz & Dixit, 2016; Di Virgilio, 2007). Wichtige Vertreter jener Signalkaskaden sind der ATP/P2X7 Signalweg oder der Nuklearfaktor-Kappa-Light-Chain- Enhancer of Activated B Cells (NFB) (Gelderblom, Sobey, Kleinschnitz, & Magnus, 2015). Der P2X7-Rezeptor ist ein homotrimerer, liganden-aktivierter nicht-selektiver Kationenkanal, welcher sowohl auf Zellen des ZNS als auch auf Zellen des Immunsystems exprimiert ist (Rissiek, Haag, Boyer, Koch-Nolte, & Adriouch, 2015). Morphologisch besteht er aus drei gleichartigen Polypeptid-Untereinheiten mit jeweils zwei Transmembrandomänen (Hattori & Gouaux, 2012; Kasuya et al., 2017). Im zentralen Nervensystem (ZNS) zeigt er die höchste Expressionsdichte auf Mikroglia, weniger auf Astrozyten und Oligodendrozyten (Hirayama, Anzai, & Koizumi, 2021; Janks, Sharma, & Egan, 2018; Yanagisawa et al., 2008; Zamanian et al., 2012). Infolge der Aktivierung des P2X7 Kanals durch extrazelluläres ATP (eATP) formen die drei Untereinheiten einen für Ionen durchlässigen Kanal, woraufhin Na+ und Ca2+ in die Zelle einströmen und K+ aus der Zelle herausströmen. Neben der Initialisierung der Ca2+ Signalkaskade bedingt der K+-Ausstrom durch den P2X7-Kanal die Formation des Nod-like receptor protein 3 (NLRP3)-Inflammasomkomplexes. Im Zuge der Aktivierung des Inflammasomkomplexes kommt es zu einer Spaltung der pro-Caspase 1 zur aktiven Caspase 1, welche selbst wiederum die Vorstufen pro-IL-1 und pro-IL-18 in deren biologisch aktive Form spaltet (Broz & Dixit, 2016; Danquah et al., 2016; Munoz-Planillo et al., 2013). Anschließend werden diese proinflammatorischen Zytokine freigesetzt und bewirken ebenfalls eine Verstärkung des sterilen Entzündungsreizes (Broz & Dixit, 2016). Speziell IL-1 scheint in diesem Zusammenhang pleiotrope Effekte zu haben. Durch die Funktion als Chemokin und als Zytokin lockt IL-1 einerseits Zellen wie neutrophile Granulozyten in die Region der Ischämie, andererseits aktiviert es weitere Zellen des angeborenen Immunsystems wie Mikroglia und führt zur Freisetzung von potenziell neurotoxischen Mediatoren wie dem Tumor-Nekrose-Faktor- (TNF-a) und iNOS mit konsekutiv induzierter Apoptose der Neuronen (Jia et al., 2022; Zhu et al., 2022). Die Menge der intrazellulär gespeicherten Interleukin-Vorstufen hängt zudem noch von weiteren Signalen durch Toll-like-Rezeptoren (TLRs) oder TNF-Rezeptoren ab sowie von einer Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFB (Liu et al., 2015; Zhu et al., 2022). Der Einfluss des P2X7-Rezeptors auf die Läsionsgröße des experimentell evozierten ischämischen Schlaganfalls konnte schon in der Vergangenheit durch verschiedene Studien gezeigt werden. So ist belegt, dass im experimentellen Setting P2X7-KO Mäuse kleinere Läsionsgrößen nach der induzierten Ischämie zeigten im Vergleich zu Mäusen des genetischen Wildtyps (Cisneros-Mejorado et al., 2015). Zudem zeigte dieselbe Studie, dass eine unspezifische Blockade des P2X7-Kanals mit einem niedermolekularen Inhibitor wie Brilliant Blue G (BBG) die Folgen des ischämischen Schlaganfalls abschwächt. Jedoch ist BBG aufgrund seiner unspezifischen Bindung an P2X-Rezeptoren und seiner Toxizität kein adäquater Kandidat für eine klinische Anwendung. Eine spezifische Bindung an den P2X7-Rezeptor können Nanobodies (Nbs) gewährleisten, ohne weitere Nebeneffekte zu zeigen. Nanobodies sind benannt nach ihrer geringen Größe mit 2,5 nm Durchmesser, 4 nm Höhe und einem Volumen von 12 kDa (Hu, Liu, & Muyldermans, 2017). Sie sind Einzeldomän-Antikörper, welche von der schweren Kette der Kameliden-Antikörper abgeleitet sind. Im Gegensatz zu den niedermolekularen Inhibitoren wie BBG zeigen Nbs eine geringe Toxizität bei hoher Spezifität dadurch geringere Nebeneffekte. Zudem erlauben sie eine weitaus potentere Inhibition des P2X7-Kanals (Danquah et al., 2016; Menzel, Schwarz, Haag, & Koch-Nolte, 2018; Rissiek, Koch-Nolte, & Magnus, 2014). Mit ihrer langen komplementären complementarity-determining-region 3 (CDR3) Region ist es Nbs möglich, an kleine Bereiche von Membranproteinen zu binden, welche normalen Antikörpern oft nicht zugänglich sind (De Genst, Saerens, Muyldermans, & Conrath, 2006; Koch-Nolte et al., 2007). Weitere Vorteile von Nbs gegenüber konventionellen Antikörpern sind ihre hohe Stabilität, ihre bessere Löslichkeit sowie ihre schnelle und zielgerichtete in vivo Distribution. Zudem sind sie einfach und ökonomisch produzierbar (Ingram, Schmidt, & Ploegh, 2018). Neben der Möglichkeit, Nb-Multimere zu bilden, können Nbs auch mit anderen Konstrukten, wie zum Beispiel der Fc-Domäne eines konventionellen Antikörpers, fusioniert werden. Hierdurch lassen sich ihre Eigenschaften mit der Fc-vermittelten Effektorfunktion, einschließlich Fc-Rezeptorbindung, verlängerter Halbwertzeit und Komplementaktivierung verbinden. Somit können Nbs als potentielles Therapeutikum viel spezifischer an die Pathophysiologien einzelner Entitäten angepasst werden als herkömmliche Antikörper (Kaczmarek-Hajek et al., 2018). In dem Hauptteil meiner Doktorarbeit beschäftige ich mich mit dem Effekt von P2X7-spezifischen Nbs auf die Läsionsgröße des ischämischen Schlaganfalls. Hierzu gehört ebenfalls eine genauere Analyse der Biodistribution mit verschiedenen Methoden der Administration sowie das Detektieren der Nbs auf verschiedenen Zellen.