Entwicklung eines Gentherapievektors für humane pulmonal-vaskuläre Endothelzellen

Abstract

Gentherapeutische Vektoren bieten die Möglichkeit, Nukleinsäure in Zellen zu transferieren und so genetisch bedingte Erkrankungen, für die es bis heute an Heilungsoptionen fehlt, ursächlich zu heilen. Die familiäre PAH ist durch genetische Veränderungen der pulmonalen Vaskulatur, resultierend in einer endothelialen Dysfunktion, bedingt. Aktuell ist kein zielgerichteter gentherapeutischer Vektor für das humane pulmonal-vaskuläre Endothelium verfügbar. Das AAV ist eins der sichersten und besterprobten Vektorsysteme, kann aber hMPVEC nicht effizient transduzieren. Mittels der Selektion randomisierter AAV- Peptidbanken lässt sich der unspezifische Tropismus des AAV auf eigentlich nicht permissive Gewebe umlenken. Im Kapsidgen des AAV-Genoms werden dafür randomisierte Peptid-kodierende Nukleotide eingefügt, die auf Kapsidebene präsentiert werden. So werden die ursprünglichen Bindungsdomänen unterbrochen und potentiell die Bindung neuer Zelloberflächenstrukturen ermöglicht. Anhand des Selektionsverfahrens lassen sich AAV-Mutanten mit Tropismus für das Zielgewebe anreichern und isolieren. In Vorarbeiten der Arbeitsgruppe wurden im Mausmodell AAV-Mutanten mit hoch sensitiven und spezifischen Tropismus für das murine pulmonal-vaskuläre Endothelgewebe isoliert. Im Zuge dieser Arbeit durchgeführte Genexpressionsanalysen dieser Mutanten in humaner Zellkultur (hPMVEC) zeigten gegenüber dem AAV-Wildtyp keine verbesserte Transgenexspression und deuten somit auf einen spezies- und gewebespezifischen, nicht übertragbaren, Tropismus von im Mausmodell selektierten AAV2-Mutanten hin. Im Zuge der daraufhin durchgeführten in vitro-Selektion einer randomisierten AAV-Peptidbank auf hPMVEC reicherten sich AAV-Mutanten mit folgenden Peptidinserts an: NEVRPHA, NRVNDHQ, DGDWLKA, LATHQTF und NDRGQAS. Die Mutante rAAV2-hEC1 (NEVRPHA) zeigte als einzige der selektierten Mutanten eine gegenüber rAAV2-wt signifikant verbesserte Transgenexpressionsrate auf hPMVEC (46,9 %, 𝜎 = 5,7 %, P= 0,0187) und eine zwar signifikant herabgesetzte, jedoch immer noch substantielle, Transgenexpressionsrate auf Kontrollzellen (HEK293T) (62,9 %, 𝜎 = 7,7 %, P= 0,002). Obwohl eine Anwendbarkeit der AAV-Mutante rAAV2-hEC1 (NEVRPHA) aufgrund mangelnder Zellspezifität für hPMVEC im Patienten eher unwahrscheinlich erscheint, kann sie aufgrund ihrer hohen Transduktionseffizienz für diese Zellen zukünftig zur weiteren in vitro-Erforschung der Pathogenese der PAH genutzt werden.