Circulating microRNAs as biomarker for cardiovascular risk prediction within the project of BiomarCaRE - Evaluation of methodical approaches

Abstract

This thesis evaluated which qPCR based method for miRNAs detection is most suitable for application in large population based cohorts such as the BiomarCaRE project and current possibilities and new approaches for circulating miRNA detection. Up to now, there is no standardised protocol for measuring miRNAs making comparability of study results difficult and clinical application of miRNAs as biomarkers impossible. Besides, this thesis points out factors influencing the detectability of miRNAs and discusses the possibilities of qPCR data normalization in order to give a wider understanding of the results when measuring and analysing miRNAs. For this thesis, samples from the BiomarCaRE case cohort set were available. For evaluation of detectability of circulating miRNAs, cel-miR-39, miR-150 and miR-133a were measured with TaqMan™ Advanced miRNA. Results showed that this assay was inadequate for the given samples. TaqMan™ microRNA and miRCURY® LNA® miRNA were tested as alternative assay approach. In summary, using TaqMan™ microRNA Assay showed the best results and can be recommended for further measurements of miRNAs in large scale human cohorts. Under all conditions, an exogenous control such as cel-miR-39 should be used to compensate for differences in extraction efficiency between samples. Moreover, the implementation of an endogenous control is recommended for reliable miRNA analysis accounting for variables before extraction from sample choice and haemolysis to storage conditions. Up to now a RT-qPCR based method for measuring miRNAs in large-scale human cohorts is the most commonly used method and comparably cost effective but also shows major disadvantages in terms of reliability and reproducibility of results. A standardisation is inevitable. Newer and not yet standardised methods raise high expectations for implementation in laboratory and clinics but must be further developed and confirmed in future studies.

In dieser Arbeit wurde untersucht, welche qPCR-basierte Methode zum Nachweis von miRNAs am besten für die Anwendung in großen populationsbasierten Kohorten wie dem BiomarCaRE-Projekt geeignet ist, sowie aktuelle Möglichkeiten und neue Ansätze zum Nachweis zirkulierender miRNAs. Bisher gibt es kein standardisiertes Protokoll zur Messung von miRNAs, was die Vergleichbarkeit von Studienergebnissen erschwert und eine klinische Anwendung von miRNAs als Biomarker unmöglich macht. Darüber hinaus zeigt diese Arbeit Faktoren auf, die die Nachweisbarkeit von miRNAs beeinflussen und diskutiert die Möglichkeiten der qPCR-Datennormalisierung, um ein breiteres Verständnis der Ergebnisse bei der Messung und Analyse von miRNAs zu ermöglichen. Für diese Arbeit standen Proben aus den BiomarCaRE-Fall-Kohorten zur Verfügung. Zur Bewertung der Nachweisbarkeit zirkulierender miRNAs wurden cel-miR-39, miR-150 und miR-133a mit TaqMan™ Advanced miRNA gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass dieser Assay für die gegebenen Proben unzureichend war. TaqMan™ microRNA und miRCURY® LNA® miRNA wurden getestet, um die beste Alternative zu bewerten. Zusammenfassend zeigte der TaqMan™ microRNA Assay die besten Ergebnisse und kann für weitere Messungen von miRNAs in großen humanen Kohorten empfohlen werden. Unter allen Umständen sollte eine exogene Kontrolle wie cel-miR-39 verwendet werden, um Unterschiede in der Extraktionseffizienz zwischen den Proben auszugleichen. Darüber hinaus wird die Implementierung einer endogenen Kontrolle für eine zuverlässige miRNA-Analyse empfohlen, die Variablen vor der Extraktion berücksichtigt, von der Auswahl des Probenmaterials über die Hämolyse bis hin zu den Lagerbedingungen. Bisher ist eine RT-qPCR-basierte Methode zur Messung von miRNAs in großen humanen Kohorten die am häufigsten verwendete Methode und vergleichsweise kostengünstig, weist jedoch auch erhebliche Nachteile hinsichtlich der Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse auf. Eine Standardisierung ist unumgänglich. Neuere und noch nicht standardisierte Methoden wecken hohe Erwartungen an die Implementierung in Labor und Klinik, müssen jedoch in zukünftigen Studien weiterentwickelt und bestätigt werden.