Molecular Processes of Neutrophil Extracellular Trap Formation in Thrombo-Inflammation

Abstract

Inflammation serves as protection against pathogen invasion and tissue injury but is also a hallmark of various diseases. Neutrophils play a crucial role in inflammation by forming Neutrophil Extracellular Traps (NETs) to combat pathogens. However, excessive NET formation and improper clearance are associated with thrombo-inflammatory disorders. The proteins PAD4, and GSDMD are considered to be critical for NET formation, while DNase1 and DNase1-like 3 (DNase1L3) are crucial for NET degradation in circulation. In our study, we investigated the importance of these factors in two independent in vivo NET formation models, sterile neutrophilia, and septicemia. Unexpectedly, mice deficient in Pad4 and Gsdmd did not survive sepsis, while the reference Myd88 knockout mice, serving as control for our disease models survived. Additionally, Pad4 and Gsdmd deficiencies did not hinder interfere with NET formation during neutrophilia, leading to lethal NET-mediated pulmonary embolism and organ damage. NETs contribute to pulmonary thrombo-inflammation in several diseases including COVID-19. Immunostaining, immunoblotting and proteomics of COVID-19 postmortem lung tissues and plasma revealed FXII expression, activation, and colocalization of FXIIa and NETs. In contrast to acute thrombo-inflammation, we did not detect these effects in long COVID patient plasma, implicating the primary importance of the NETs/FXIIa axis in acute inflammation. Furthermore, we detected NET markers in plasma and cerebral venous sinus thrombi of patients with the SARS-Cov-2 vaccine-induced condition VITT. Impaired NET clearance by DNases contributed to NET accumulation and FXII activation in COVID-19 plasma, which was improved by DNase1 substitution. Consequently, the prevention of the pathological effects of NETs largely depends on efficient degradation by DNases, which led us to the engineering of recombinant human DNase1 variants. Zymography and gel electrophoresis assays showed that the transfer of three amino acid stretches from DNase1L3 to DNase1 resulted in a hyperactive enzymatic variant capable of degrading dsDNA, chromatin, and NETs efficiently. Collectively, our findings demonstrate the involvement of the NETs/FXIIa axis in COVID-19 and VITT and propose DNase-based interventions to mitigate NET-driven and thrombo-inflammatory pathologies.

Neutrophile spielen eine entscheidende Rolle bei Entzündungen, indem sie Neutrophil Extracellular Traps (NETs) bilden, um Pathogene zu bekämpfen. Eine übermäßige NET-Bildung und ein unzureichender Abbau sind jedoch mit thrombo-inflammatorischen Störungen verbunden. Die Proteine PAD4 und GSDMD gelten als entscheidend für die NET-Bildung, während DNase1 und DNase1-like 3 (DNase1L3) für den NET-Abbau im Blutkreislauf notwendig sind. In dieser Studie haben wir den Einfluss von PAD4 und GSDMD für NET-vermittelte Gefäßverschlüsse und Organschäden in der sterilen Neutrophilie und der Septikämie, untersucht. Unerwarteterweise überlebten Pad4- und Gsdmd-defiziente Mäuse die sterile Neutrophilie und die Septikämie nicht. Pad4- und Gsdmd-Defizienz reduzierte die NET-Bildung bei Neutrophilie nicht, was zu tödlichen NET-vermittelten Lungenembolien und Organschäden führte. NETs tragen weiterhin zur pulmonalen Thrombo-Inflammation bei COVID-19 bei. Immunfärbungen, Immunblots und Proteomik von postmortalen Lungengeweben und Plasma von COVID-19-Patient*innen zeigten erhöhte FXII-Expression, -Aktivierung und eine Kolokalisation von FXIIa und NETs. In long COVID Plasma konnten wir prokoagulante Effekte nicht nachweisen, was primär auf die Bedeutung der NETs/FXIIa-Achse bei akuten Entzündungen hindeutet. Darüber hinaus wiesen wir NET-Marker im Plasma und in zerebralen venösen Sinusthromben von Patient*innen mit der durch den AstraZeneca SARS-CoV-2-Impfstoff ausgelösten Vakzin-induzierten immunthrombotischen Thrombozytopenie (VITT) nach. Ein gestörter NET-Abbau durch DNase-Defizienz trug zur NET-Akkumulation und FXII-Aktivierung bei, was durch DNase1-Substitution verbessert wurde. Die Verhinderung der pathologischen Auswirkungen von NETs hängt weitgehend von einem effizienten Abbau durch DNasen ab, was uns zur Entwicklung von rekombinanten humanen DNase1-Varianten führte. Zymographie- und Gelelektrophorese-Assays zeigten, dass die Übertragung von drei Aminosäuresequenzen von DNase1L3 auf DNase1 zu einer hyperaktiven enzymatischen Variante führte, die in der Lage ist, dsDNA, Chromatin und NETs effizient abzubauen. Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse die Beteiligung der NETs/FXIIa-Achse an thrombo-inflammatorischen Ereignissen bei COVID-19 und schlagen DNase-basierte Interventionen zur Verringerung von Koagulopathien und übermäßigen Entzündungsreaktionen in der Lungenpathologie von COVID-19 vor.