Entwicklung verbesserter Methoden zum Nukleinsäurenachweis von Brugia malayi und Brugia timori, Erregern der Lymphatischen Filariasis in Indonesien

Abstract

Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines einfachen, sensitiven und kostengünstigen molekularbiologischen Nachweisverfahrens für Brugia malayi DNA im Blut unter besonderer Berücksichtung der Anwendbarkeit in den zumeist einfach ausgestatteten Laboratorien endemischer Länder.

Als einfache und effektive Konservierungs- und Extraktionsmethode untersuchte ich die Konservireung von Kapillarblut auf Filterpapier mit anschließender Chelex-DNA-Extraktion. Beide Verfahren stellten sich als einfache und zuverlässige Methoden heraus. Sie waren geeignet, die Probensammlung bedeutend zu vereinfachen, und ermöglichten eine kostengünstige Extraktion sowie eine sensitive PCR-Diagnostik. Mit Hilfe eines anschließenden PCR-ELISA konnte sensitiv B. malayi DNA nachgewiesen werden, selbst bei einigen Proben, die nur über geringe Mf-Dichten verfügten. Auch konnten diese Methoden zur Untersuchung von Tagblut verwendet werden, was eine weitere Vereinfachung dieser Diagnostik ermöglichte.

Die Effektivität des verwendeten PCR-Nachweisverfahrens konnte gesteigert und verbessert werden. Zum ersten Mal konnte mit Hilfe dieser für B. malayi verwendeten PCR-Diagnostik B. timori DNA nachgewiesen werden. Auch war es im Rahmen einer Multiplex-PCR möglich, P. falciparum DNA nachzuweisen. Erste Untersuchungen zur Methode der branched DNA zeigten, daß das HhaI-Repeat für einen solchen Nachweis ebenfalls geeignet ist. Diese Ergebnisse belegen eine umfangreiche und vor allem vielfältige Anwendbarkeit dieser Diagnostikmethode.

Der DNA Detection Test Strip erwies sich als vereinfachte Methode zum Nachweis von PCR-Produkten. Im Vergleich zum aufwendigen PCR-ELISA stellte er sich als ein sehr schnelles und einfaches Nachweisverfahren mit nahezu gleicher Sensitivität heraus. Der Test Strip trägt gemeinsam mit der vereinfachten Probengewinnung durch die Methode der Blood spots und anschließender Chelex-Extraktion dazu bei, den Nachweis von Brugia Infektionen bedeutend zu beschleunigen und zu vereinfachen.

This dissetation based of an improvement of diagnostic tools for the detection of Brugia malayi and Brugia timori, wich is need for the monitoring of the success of intervention efforts.

In my study I report the use of a simplified method for sample collection and preparation of DNA templates by using dried blood spots, Chelex extraction and PCR-Diagnostik.

By this method it was also possible to detect P. falciparum by a multiplex-PCR. And also first steps to develope a branched DNA detection were done.

By using the DNA detection test strip this methods are shown to be very quick and also more simple, which is important for beeing used in the global elimination efforts for lymphatic filariasis.