Generierung von NPR3-, MERTK- und ITM2B-Knockout-Zelllinien mittels CRISPR/Cas9

Abstract

Die Expressionsprodukte der Gene NPR3, MERTK und ITM2B konnten bei einer Analyse des Interaktoms der wichtigsten Schlitzmembrankomponenten Nephrin, Neph1 und Podocin als interagierende Moleküle identifiziert werden. Die Schlitzmembran, als Bestandteil der Filtrationsbarriere liefert einen entscheidenden Beitrag zur Generierung des Primärharns. Zusätzlich können bei vielen nephrologischen Krankheitsbildern pathologische Veränderungen dieser Zell-Zellverbindung zwischen Blut und Urin beobachtet werden. Welche Rolle diesen neu in der Schlitzmembran identifizierten und aus anderem Kontext bereits bekannten Moleküle jedoch zuzuschreiben ist, bleibt weiterhin ungeklärt. Durch Identifizierung ihrer Funktion und Bedeutung für die Integrität und Funktionalität des hoch spezifischen und einzigartigen Zell-Zell-Kontaktes, der die einwandfreie Funktion der Filtrationsbarriere nachhaltig beeinflusst, könnten potenziell andere weitgreifende und auch in pathologischen Kontexten bestehende Fragestellungen beantwortet werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, mithilfe der Genome Editing Methode CRISPR/Cas9 drei Podozyten-Zelllinien zu generieren, in denen jeweils eines der genannten Gene ausgeknockt wurde. Der Generierungsprozess dieser Zelllinien beinhaltete die Erstellung spezifischer gRNAs, die die Nuklease Cas9 an den gewünschten Genomlokus navigieren, sowie die Etablierung der Transfektion einer murinen und einer humanen Podozyten-Zelllinie. Transfizierte Zellen wurden dann mittels FACS zu Einzelzellen separiert, deren Expansion zu genetisch identischen Zellkolonien führen sollte. Die Validierung des Genomeditierungserfolges wurde in drei Schritten vorgenommen. Ein erstes PCR-Screening mit anschließendem Enzymverdau lieferte mögliche Kandidaten, die dann mittels der Sanger-Sequenzierung genetisch genauer charakterisiert wurden. Abschließend wurde die Proteinexpression im Western Blot oder die mRNA-Expression in der qPCR analysiert. Es konnten auf diese Weise für jedes Gen sowohl Knockout- als auch Wildtyp-Zellen entwickelt werden, die für nachfolgende Experimente zur Verfügung stehen. Im Zentrum zukünftiger Untersuchungen steht die Identifikation ihrer Bedeutung als Schlitzmembrankomponenten. Dies soll durch den Vergleich der Knockout-Zellen mit der Wildtyp-Variante bei der Durchführung verschiedener Assays erlangt werden. Parallel soll die Einführung entsprechender Knockout-Mauslinien in vivo Ergebnisse liefern. Erst mithilfe dieses grundlegenden Wissens können potenziell krankheitsrelevante Aspekte abgeleitet werden und so neue Möglichkeiten für Therapieoptionen geschaffen werden. Mit Daten aus dieser Doktorarbeit publizierter peer-review Artikel: „A slit-diaphragm-associated protein network for dynamic control of renal filtration.“ (Kocylowski MK, Aypek H, Bildl W, Helmstädter M, Trachte P, Dumoulin B, et al. A slit-diaphragm-associated protein network for dynamic control of renal filtration. Nat Commun. 2022;13(1):1–15)