Humane PAK5, ein Inhibitor der Kinase MARK2, reguliert die Stabilität des Mikrotubuli- und Aktinnetzwerks

Abstract

Die Familie der MARK-Kinasen ist an der Entwicklung und Erhaltung zellulärer Polarität beteiligt. Ursprünglich wurde MARK (MAP/Mikrotubuli-Affinität regulierende Kinase) aufgrund seiner Fähigkeit entdeckt, das neuronale Mikrotubuli-assoziierte Tau Protein zu phosphorylieren. Eine durch MARK ausgelöste Phosphorylierung bewirkt die Ablösung des Tau Proteins von den Mikrotubuli (MT) und führt im Folgenden zu deren Destabilisierung. Diese Reaktion könnte zur Bildung der intrazellulären abnormalen Tauaggregate (PHFs, paarige helikale Filamente) führen, welche die Alzheimer Krankheit kennzeichnen.

In dieser Arbeit wurde mittels des Zwei-Hybrid-Systems nach neuen Interaktionspartnern der Serin/Threonin Kinase MARK gesucht. Neben dem in der Literatur bekannten Bindungspartner 14-3-3 konnte die Kinase PAK5 als neuer Interaktionspartner von MARK identifiziert werden. PAK5 wird gehirnspezifisch exprimiert und gehört der p21-aktivierten Kinase Familie an. Einige ihrer Mitglieder werden durch Rac/Cdc42 reguliert und üben als GTPase-Effektoren eine wichtige Funktion bei der Regulation des Aktinnetzwerks aus. Im Gegensatz dazu sind Funktion und Regulation von PAK5 noch nicht eindeutig geklärt. Eine PAK5-Überexpression in neuronalen Zellen führt zur Bildung von Neuritenauswüchsen, Filopodien und dendritischen Verästelungen. Die Regulation von PAK5 über Cdc42 wird in der Literatur widersprüchlich diskutiert.

Eine Bestätigung der im Zwei-Hybrid-Screen charakterisierten Interaktion zwischen MARK und PAK5 erfolgte durch biochemische Präzipitationsanalysen und zellbiologische Kolokalisationsstudien. Desweiteren konnte der funktionale Zusammenhang der beiden Kinasen näher bestimmt werden. Überexpressionsexperimente in CHO-Zellen zeigten deutlich, dass PAK5 als Inhibitor der MT-destabilisierenden Kinase MARK fungiert. So konnte in MARK/PAK5 kotransfizierten Zellen ein dynamisches Aktin- und ein stabiles Mikrotubulinetzwerk nachgewiesen werden. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse der in vitro Kinaseassays, dass diese Inhibierung durch Bindung und nicht durch Phosphorylierung erfolgt. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Kinasen MARK und PAK5 eine wichtige Rolle bei der Regulation des Zytoskeletts spielen, wobei der „Aktinschalter“ PAK5 den „MT-Schalter“ MARK in seiner MT-destabilisierenden Funktion inhibiert.

Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die in der Literatur beschriebene Autoregulation von PAK5 überprüft. Im Gegensatz zu Ching et al. (2003) konnte im Kinaseassay eine Autoinhibierung der PAK5 durch das N-terminale AID-Fragment (AS 1-181) nicht bestätigt werden.

Der Aktinstabilisator LIMK1 wird durch PAK4 phosphoryliert und aktiviert. Aufgrund der großen Sequenzhomologie zwischen PAK4 und PAK5 wurde in Zwei-Hybrid-Experimenten eine mögliche Interaktion zwischen PAK5 und der Kinase LIMK1 untersucht. Eine Wechselwirkung konnte hierbei genauer charakterisiert werden. Allerdings lassen die zellbiologischen Ergebnisse vermuten, dass PAK4 und PAK5 das Aktinnetzwerk auf gegensätzliche Weise regulieren.