DC ElementWertSprache
dc.contributor.advisorChapman, Henry-
dc.contributor.advisorRedecke, Lars-
dc.contributor.advisorFischer, Markus-
dc.contributor.authorLahey-Rudolph, Janine Mia-
dc.date.accessioned2024-07-30T12:52:50Z-
dc.date.available2024-07-30T12:52:50Z-
dc.date.issued2024-02-
dc.identifier.urihttps://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/11053-
dc.description.abstractDie Aufklärung hochauflösender dreidimensionaler Strukturen von Proteinen mittels Röntgenstrukturanalyse erfordert Proteinkristalle zur Signalverstärkung. Proteinkristalle wurden in lebenden Zellen aller Domänen beobachtet. Ergänzend zu konventionellen Kristallisationsmethoden wurde in der vorliegenden kumulativen Arbeit ein systematischer Ansatz für die Kristallisation rekombinanter Proteine in lebenden Insektenzellen verfeinert und ausgeweitet. Dabei wurde insbesondere die Detektion der Kristalle in cellulo verbessert, indem eine Kleinwinkelstreuung/ Pulverdiffraktions Methode zum Screenen von Zellkulturen entwickelt wurde. Dafür wurden mit rekombinanten Baculoviren infizierte Zellkulturen an einer Hintergrund-optimierten Synchrotron-Strahlführung vermessen und mit Mockvirus infizierten und mit uninfizierten Insektenzellkulturen verglichen. Sind Kristalle in der Zellkultur vorhanden, so liegen bei dieser Messung Beugungssignale in zufälliger Orientierung vor. Dadurch werden auf dem Detektor schwache unvollständige Debye-Scherrer Ringe aufgenommen, die durch Summation mehrerer Bilder, radialer Mittlung und Hintergrundsubtraktion in 1D-Plots der Streuwinkelkurve als Peaks erscheinen. Es konnte gezeigt werden, dass bei einer minimalen Kristallbildungsrate von unter einem bis etwa sechs Prozent ausreicht, um innerhalb von Sekunden Proteinmikrokristalle in der Zellkultur zu identifizieren. Die minimal notwendige Kristallbildungsrate ist v.a. abhängig vom expremierten Zielgen. Um die Effizienz und Sensitivität der Methode bestimmen zu können wurden dafür Proteine gewählt, die in cellulo deutlich mit Lichtmikroskopie sichtbare Kristalle bilden. Die Dynamik der Kristallbildung in den Zellen wurde im Ensemble untersucht. Dadurch konnte der optimale Zeitpunkt für das serielle Kristallographieexperiment ermittelt werden. Serielle Kristallographie (SX) Beugungsdatenaufnahme mittels einer Synchrotron Strahlungsquelle und Freie Elektronenlasern wurde in cellulo - also ohne vorherige Extraktion und Reinigung der Kristalle aus den Zellen - etabliert, da sich gezeigt hat, dass kein erhöhtes Hintergrundsignal bei Datenaufnahme in lebenden Zellen auftritt, und die umgebende Zelle die Proteinkristalle vor etwaigen Schäden durch das Isolationsverfahren und vor Dehydration schützt. Am Synchrotron wurde anhand verschiedener Konstrukte der Proteine N. crassa HEX-1 und T. brucei Inosinmonophosphatdehydrogenase (TbIMPDH) die Datenaufnahme in MicroMeshes (MiteGen) mit einem helikalen Linienscan gezeigt und die Strukturen gelöst. Auch die Datenaufnahme bei Raumtemperatur (RT) wurde demonstriert, wobei es durch die Verwendung von CrystalDirectTM Platten nach Beschichtung mit Poly D Lysin möglich war, sowohl eine rekombinante Bakulovirus (rBV) Infektion, Kristallwachstum als auch die Datenaufnahme in cellulo und in situ durchzuführen. Dies vermeidet Schäden an potentiell fragilen Kristallen. Diffraktionsdatensammlung bei RT kann alternative Konformere aufdecken und ermöglicht automatisierbare Datenaufnahme an bis zu 96 Proben ohne Trägerwechsel. SX in cellulo am Freie Elektronenlaser LCLS wurde mit einem fixed-target Verfahren erfolgreich demonstriert. Im Vergleich zur Probenlieferung mit einem Liquid Jet entfallen die Risiken von Verstopfung einer Düse oder Sedimentieren der Probe im Reservoir. Somit kann eine hohe Trefferquote erzielt werden. Interessanterweise ermöglicht Kristallisation in der lebenden Zelle die Bindung von genuinen Kofaktoren, welche in physiologischer Konzentration in den Kristall diffundieren oder kokristallisieren. Wird auch die Datenaufnahme in intakten Zellen durchgeführt, können diese Kofaktoren bei ausreichend starker Bindung und Datenqualität identifiziert werden. Auf diese Weise konnte gezeigt werden, dass die inhibierende Konformation der TbIMPDH ein Phosphat an der IMP Bindungsstelle inkorporiert, und in den kanonischen Nukleotidbindungsstellen GDP und ATP mit einer alternativen Konformation. Für die Lösung der Struktur nach erfolgreicher Diffraktionsdatensammlung gibt es die Möglichkeiten des molekularen Ersatzes, sei es mit einer bereits experimentell gelösten homologen Struktur oder seit AlphaFold2 auch anhand eines in silico Modells. Um Bias zu vermeiden wurde angestrebt schwere Atome in intrazelluläre Kristalle einzubringen, anhand derer de novo Phasierung getestet werden könnte. Es wurden erfolgreich TbIMPDH Konstrukte mit einem Lanthanid-Bindetag (LBT) intrazellulär kristallisiert. Diese Kristalle zeigten eine geringere Stabilität. SAD-Phasierung von Test-Diffraktionsdaten der TbIMPDH mit terminalem LBT war nicht möglich, weil Terbium intrazellulär nicht ausreichend spezifisch bindet und sich nach Kristallisolation die Auflösung der Diffraktionsdaten durch Terbium-Soaking reduziert. Als alternativen Ansatz wurde die Inkorporation von Selen als Selenomethionin während der Genexpression getestet. Durch rBV Infektion der mit einem sehr hohen Virustiter (MOI 10) konnte eine erhöhte Inkorporation von Selen in den Kristallen mittels Massenspektrometrie für Neurospora crassa HEX-1 nachgewiesen werden. Dieser Ansatz ist vielversprechend für eine zukünftige SAD-Phasierung, sollte jedoch für weitere Proteine validiert werden. Die Resultate dieser kumulativen Dissertation leisten einen Beitrag zum Methodensprektrum der Strukturbiologie, indem die in cellulo Kristallisation für eine größere Gruppe Wissenschaftler durch vereinfachte Detektion und serielle Datenaufnahme in intakten Insektenzellen als Ergänzung zu konventioneller in vitro Kristallisation zugänglich gemacht wird.de
dc.description.abstractElucidation of high-resolution three-dimensional protein structures via X-ray crystallography requires protein crystals for signal enhancement. Protein crystals have been observed in living cells from all domains of life. This cumulative dissertation refines and expands a systematic approach for crystallization of recombinantly introduced proteins in living insect cells, as a complementary method to conventional crystallization approaches. In particular, detection of crystals in cellulo has been optimized by development of a small angle X-ray scattering/ powder diffraction synergistic method to screen cell cultures. To this end, recombinant baculovirus infected cell cultures were measured at a low-background optimized synchrotron beamline. Their X-ray scattering profile was compared to that of mockvirus-infected and uninfected insect cells. If protein crystals are irradiated, they are in random orientation within the cells. Consequently, weak incomplete Debye-Scherrer rings are recorded, which by summation of multiple detector images, radial averaging, and background subtraction show as peaks in the 1D-plots of the scattering curve. It could be shown that a crystallization efficiency in cells of less than one to six per cent suffices to identify within seconds if there are protein microcrystals within a cell culture. This is largely dependant on the expressed target protein. To this end, proteins were chosen that form clearly visible crystals identifieable by light microscopy. Thus, the efficiency and sensitivity of the established method could be elucidated. Additionally, the dynamic behaviour of crystal growth within the cell ensemble was investigated. This enabled determination of the optimal timepoint after infection for a serial crystallography (SX) experiment. It became clear that data collection within living cells, meaning in cellulo with no prior extraction and purification of crystals, does not increase background noise. Going further, the surrounding cell even protects protein crystals from dehydration and damage during crystal extraction. In this work, SX data collection in cellulo was established at synchrotron radiation sources and using X-ray free-electron laser (XFEL) radiation. With synchrotron radiation, efficient data collection on MicroMeshes (MiteGen) with helical line scans is demonstrated on different constructs of the proteins Neurospora crassa HEX-1 (NcHEX-1) and Tb inosine 5’-monophosphate dehydrogenase (TbIMPDH), solving the structures. In addition, data collection at room temperature (RT) is demonstrated. Using CrystalDirectTM plates with a poly D-lysine coating for enhanced cell adhesion, everything from cell infection, crystal growth up to data collection in the intact cells can be done in situ. This way, any damage on potentially fragile intracellular crystals is prevented. Collecting at RT can also uncover potential alternative conformers. The method enabels automatable data collection on up to 96 sampels without changing the mount. Successful SX in cellulo on XFELs is demonstrated with a fixed-target approach on micro-patterned silicon chips. Compared to liquid jets, risks of nozzle clogging or crystal sedimentation in the sample reservoir are eliminated, reducing sample consumption and increasing hitrates. Interestingly, crystallization inside cells enables binding of genuine co-factors abundant at physiological concentrations. Ligands can either diffuse into or co-crystallize with the crystal. Collecting diffraction data in viable insect cells can lead to identification of such co-factors, provided sufficiently strong binding and data quality. This way it can be shown that the inactive conformation of TbIMPDH incorporates phosphate at the IMP binding site, as well as GDP and ATP in alternate conformations at canonical nucleotide binding sites. Solving the structure after successful data collection can be done by phase retrieval with molecular replacement. Phases can be transfered from a experimentally phased homologue, or more recently from in silico models generated f.i. with AlphaFold2. In order to prevent bias, it is still desirable to introduce heavy atoms into intracellular protein crystals, which later could be used for experimental de novo phasing. Towards this end, TbIMPDH constructs with terminal lanthanide binding tags (LBT) were successfully crystallized in cellulo, unfortunately leading to increased crystal fragility compared to the TbIMPDH in cellulo crystals without LBT. Moreover, unspecific binding of the lanthanide terbium to other moelcules within the cell was confirmed, and, terbium soaking reduced resolution of diffraction data. As an alternate approach, the incorporation of selenium in the form of selenium methionine was tested on different targets during gene expression. It was hypothized and proven by mass spectrometry for NcHEX-1 that a high virus titer (MOI 10) results in an increased selenium incorporation. The potential of this approach for a future phasing via SAD needs to be validated on additional proteins. Results of this cumulative dissertation contribute to the method spectrum of structural biology, opening the approach of in cellulo crystallization to a wider group of researchers. Crystal detection and serial data collection in living cells has been simplified and optimized, rendering the method an alternative crystallization method.en
dc.language.isoende_DE
dc.publisherStaats- und Universitätsbibliothek Hamburg Carl von Ossietzkyde
dc.relation.haspartdoi:10.1107/S1600576720010687de_DE
dc.relation.haspartdoi:10.1107/S2052252521005297de_DE
dc.relation.haspartdoi:10.1038/s41467-024-45985-7de_DE
dc.rightshttp://purl.org/coar/access_right/c_abf2de_DE
dc.subjectin cellulo crystallizationen
dc.subjectserielle Femtosekunden Kristallographiede
dc.subjectserielle Protein Kristallographiede
dc.subjectInsektenzellkulturde
dc.subjectphase separationen
dc.subject.ddc500: Naturwissenschaftende_DE
dc.titleSerial protein crystallography in celluloen
dc.title.alternativeSerielle Proteinkristallographie in cellulode
dc.typedoctoralThesisen
dcterms.dateAccepted2024-07-05-
dc.rights.cchttps://creativecommons.org/licenses/by/4.0/de_DE
dc.rights.rshttp://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/-
dc.subject.bcl38.31: Kristallographiede_DE
dc.subject.gndStrukturbiologiede_DE
dc.subject.gndKristallographiede_DE
dc.subject.gndZellkulturde_DE
dc.subject.gndIn vivode_DE
dc.subject.gndMassenspektrometriede_DE
dc.type.casraiDissertation-
dc.type.dinidoctoralThesis-
dc.type.driverdoctoralThesis-
dc.type.statusinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionde_DE
dc.type.thesisdoctoralThesisde_DE
tuhh.type.opusDissertation-
thesis.grantor.departmentChemiede_DE
thesis.grantor.placeHamburg-
thesis.grantor.universityOrInstitutionUniversität Hamburgde_DE
dcterms.DCMITypeText-
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:18-ediss-119789-
item.creatorOrcidLahey-Rudolph, Janine Mia-
item.creatorGNDLahey-Rudolph, Janine Mia-
item.grantfulltextopen-
item.fulltextWith Fulltext-
item.advisorGNDChapman, Henry-
item.advisorGNDRedecke, Lars-
item.advisorGNDFischer, Markus-
item.languageiso639-1other-
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen
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2024_Dissertation_Lahey-Rudolph.pdfSerial protein crystallography in cellulo: Kumulative Dissertation FB Chemie Uni Hamburg - JM Lahey-Rudolph3caed0e66b51401c81a90317773c1c2c20.58 MBAdobe PDFÖffnen/Anzeigen
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