Investigating the role of tyrosine-protein kinase MER in human breast cancer

Abstract

Cancer is the second leading cause of death worldwide accounting for an estimated mor-tality of 9.9 million per year (Ferlay et al., 2021) among which breast cancer is ranked sec-ond (Brayet al., 2018). MERTK expression has repeatedly been reported in multiple tumor entities ranging from hematologic to solid tumors (Graham et al., 2014). This study inves-tigated the effects of MERTK and characterized M6M3, a novel MERTK-targeting monoclo-nal antibody, in human breast cancer. We validated strong affinity of M6M3 exclusively to human MERTK in ELISA affinity assays. Treatment with M6M3 led to profound MERTK degradation via Western Blot analysis. Through fluorescent-activated flow cytometry, we demonstrated reduced expression on the cell surface. Direct inhibition of cancer cell proliferation upon M6M3 treatment could not be detected. However, pretreatment with M6M3 resulted in significantly reduced col-ony formation. In order to assess effects of MERTK in the microenvironment, immunocompe-tent Mertk –/– mice where challenged with the syngeneic colon cancer CT26 and breast cancer 4T1 cell lines. A reduction in primary tumor growth was detected between the Mertk –/– and control group depending on the cancer entity. Apoptotic cell burden and neoangiogenesis were unaffected by Mertk –/–. With the aim to assess the direct therapeu-tic efficacy in vivo we transplanted the human breast cancer cell line MDA-MB-231 into an immunodeficient mouse model and administered intravenously one cohort with M6M3 and the other cohort with isotype control mIgG. Orthotopic primary tumor growth after termination of the experiment was unaffected by M6M3 treatment. Next, we transplanted the metastatic derivative cell line MDA-LM2 in a metastatic tumor growth assays and ob-served that M6M3 treatment has a significant growth-inhibiting effect in the initiation phase (days 10 – 18) via bioluminescent in vivo measurement. This finding indicates a higher dependency on MERTK in metastatic formation. The studies presented in this the-sis showed promising pre-clinical results in support of targeting MERTK therapeutically. Both in vitro and in vivo experiments conducted with M6M3 have demonstrated phenotyp-ic effects on MERTK. Thus, M6M3 shows potential as a cancer therapy candidate that may be translated into clinical application.

Krebs ist die zweithäufigste Todesursache weltweit mit einer geschätzten Sterblichkeit von 9,9 Millionen pro Jahr (Ferlay et al., 2021), wobei Brustkrebs an zweiter Stelle steht (Bray et al., 2018). Die Expression von MERTK wurde wiederholt in verschiedenen Tumorentitäten, von hämatologischen bis hin zu soliden Tumoren festgestellt (Graham et al., 2014). In dieser Dissertation wurden die Auswirkungen von MERTK untersucht und M6M3, ein neuartiger MERTK-spezifischer monoklonaler Antikörper in menschlichem Brustkrebs charakterisiert. In ELISA-Affinitäts-Assays konnten wir eine hohe Affinität von M6M3 ausschließlich zu menschlichem MERTK nachweisen. Die Behandlung mit M6M3 führte zu einem signifikanten MERTK-Abbau mittels Western-Blot-Analyse. Mittels fluoreszenzaktivierter Durchflusszytometrie konnten wir eine reduzierte Expression auf der Zelloberfläche nachweisen. Eine direkte Hemmung der Proliferation von Krebszellen durch die Behandlung mit M6M3 konnte nicht festgestellt werden. Die Vorbehandlung mit M6M3 führte jedoch zu einer deutlich reduzierten Koloniebildung. Um die Auswirkungen von MERTK auf die Mikroumgebung zu untersuchen, wurden immunkompetente Mertk -/- Mäuse mit den syngenen Darmkrebs- CT26- und Brustkrebs- Zelllinien 4T1 befallen. Je nach Krebsart wurde eine Verringerung des Primärtumorwachstums zwischen der Mertk -/- und der Kontrollgruppe festgestellt. Die apoptotische Zelllast und die Neoangiogenese wurden durch Mertk -/- nicht beeinträchtigt. Um die direkte therapeutische Wirksamkeit in vivo zu untersuchen, ransplantierten wir die humane Brustkrebszelllinie MDA-MB-231 in ein immundefizientes Mausmodell und verabreichten einer Kohorte intravenös M6M3 und der anderen Kohorte die Isotyp-Kontrolle mIgG. Das Wachstum des orthotopen Primärtumors nach Beendigung des Experiments wurde durch die M6M3-Behandlung nicht beeinflusst. Als Nächstes transplantierten wir die metastasierende Zelllinie MDA-LM2 in einem metastasierenden Tumorwachstumstest und beobachteten, dass die Behandlung mit M6M3 in der Initiationsphase (Tage 10 - 18) mittels biolumineszenter in-vivo-Messung eine signifikante wachstumshemmende Wirkung hat. Dieser Befund deutet auf eine stärkere Abhängigkeit von MERTK bei der Metastasenbildung hin. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse zeigen vielversprechende präklinische Ergebnisse, die einen therapeutischen Ansatz gegen MERTK unterstützen. Sowohl in vitro als auch in vivo durchgeführte Experimente mit M6M3 haben phänotypische Auswirkungen auf MERTK gezeigt. Somit zeigt M6M3 Potenzial als Krebstherapiekandidat, der in die klinische Anwendung überführt werden kann.