Tripartite Separation of Glomerular Cell Types and Proteomes from Reporter-Free Mice

Abstract

Der Glomerulus der Niere besteht aus 3 zellulären Hauptbestandteilen: Podozyten, Mesangialzellen und Endothelzellen. Gemeinsam sind sie für die Bildung und Aufrechterhaltung der glomerulären Filtrationsbarriere verantwortlich, ein Funktionsverlust dieser Struktur resultiert im nephrotischen Syndrom. Die Erforschung des Glomerulus stellt daher eine fundamentale Voraussetzung für das Erlangen pathogenetischen Verständnisses glomerulärer Erkrankungen sowie die Entwicklung effektiver Therapien dar. Ziel dieser Arbeit war es, eine Methodik zu entwickeln, die es erlaubt alle 3 Zelltypen aus einer Wildtyp-Maus zu isolieren und für beliebige nachfolgende Analysen nutzbar zu machen, genannt timMEP. timMEP verläuft in 5 Schritten: Entnahme muriner Nieren, Isolation der Glomeruli, Herauslösen der Zellen aus den Glomeruli, Markierung der Zellen mit zelltypspezifischen fluoreszenzgekoppelten Antikörpern und Sortierung der Zellen in einem FACS. Die Reinheit der erhaltenen Zellpopulationen wurde unter Nutzung konfokaler Mikroskopie, qPCR, Western Blots und Proteomics bestätigt. timMEP erlaubt es Untersuchungen an den 3 Hauptzellbestandteilen eines Individuums durchzuführen und ebnet somit den Weg für Experimente mit glomerulären Zellen in einem bisher unerreichtem Detailgrad.

The kidney’s glomerulus consists of 3 main cellular components: podocytes, mesangial cells and endothelial cells. Together they are responsible for the formation and maintenance of the glomerular filtration barrier, a loss of function of this structure results in the nephrotic syndrome. Consequently, the investigation of the glomerulus is a fundamental prerequisite for gaining a pathogenetic understanding of glomerular diseases and the development of effective therapies. The aim of this work was to develop a protocol that enables the isolation of all 3 cell types from the same individuum. We call this method timMEP. timMEP consists of 5 steps: harvest of murine kidneys, isolation of the glomeruli, extraction of the cellular components, labeling the cells with cell-type-specific fluorescence-coupled antibodies and fluorescence- activated cell sorting. The purity of the obtained cell populations was confirmed using confocal microscopy, qPCR, Western blots and proteomics. timMEP enables glomerular cell type–resolved investigations in unprecedented detail.