The B7 protein family as ligands for Killer Cell Immunoglobulin-like Receptors (KIRs)

Abstract

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) were first described on NK cells and CD8 T cells but are known to be present on more immunological subsets [1–5]. Interestingly, all 15 known KIR genes are encoded in the MHC region and are extensively characterised besides KIR3DL3 [6–9]. KIR3DL3 which was long considered to be a pseudogene, as no protein was detectable on the cell surface nor intracellularly, is evolutionarily conserved among humans [10]. Besides of its lacking proof of expression KIR3DL3 was considered an orphan receptor until recently B7-H7 (HHLA2) was identified as ligand for KIR3DL3 [11]. The B7 protein family itself, first described as receptors of B cells, contains a collection of important immunological molecules such as B7-1 (CD80), B7-2 (CD86) and B7-H1 (PD-L1) which are known regulators of T cells of the adaptive immune response [12–15]. Furthermore, the family contains NK cell regulators such as B7-H6 for the NK cell activating receptor NKp30 [16]. The thesis therefore tries to identify potential additional KIR B7 protein interactions through the methods of a protein based high throughput screen (HTS) and follows up on potential new interaction partners with cell-based binding and cytotoxicity assays to investigate a possible biological relevance. The distribution of identified interaction partners in humans are assessed through compartment studies. Overall, the HTS identified the known interaction partners of KIR3DL3 & B7-H7, NKp30 & B7-H6 and a novel interaction of KIR3DL2 & B7-H1 (PD-L1) which could not be validated on a cellular basis. The follow up experiments focusing on the KIR3DL3 & B7-H7 interplay confirmed the inhibitory nature of the interaction on a cellular level. Furthermore, peripheral blood is a compartment in which both receptors are present and could interact. In summary, the presented dissertation points out that the function of the KIR3DL3 receptor remains poorly understood and characterised. Furthermore, the key role within the human immune system is not solved. Future work will have to focus on potential effects of KIR3DL3 knock outs to shed light on the question why the gene is evolutionarily conserved, yet only scarcely expressed on different tissues and cell systems in different individuals. Additionally, it is of interest to understand the role of the KIR3DL3 & B7-H7 axis in infectious diseases as both molecules are present on important immune cells. B7-H7 is highly overexpressed in multiple tumours such as renal cell carcinoma, acute lymphoblastic leukaemia, non-small lung cancer, gallbladder, and stomach cancer [11, 17–26]. Some answers to the elusive interaction might also come from clinical trials as a novel checkpoint antigen. The ongoing clinical phase I trials of the monoclonal antibodies NPX267 and HBM1020 targeting the KIR3DL3 & B7-H7 axis may help to shed light on the significance of the interaction.

Killerzell-Immunglobulin-ähnliche Rezeptoren (KIRs) wurden zuerst auf NK Zellen und CD8 T Zellen nachgewiesen. Heute weiß man jedoch, dass sie auch auf anderen Immunzellen vorhanden sind [1–5]. Interessanterweise sind alle 15 bekannten KIR Gene in der MHC Region codiert und bis auf KIR3DL3 ausführlich charakterisiert [6–9]. KIR3DL3, welches lange Zeit als Pseudogen behandelt wurde, da man keine Proteinexpression auf der Zelloberfläche oder innerhalb der Zelle nachweisen konnte, ist in allen Menschen konserviert [10]. Ein zusätzlicher Grund, weshalb KIR3DL3 als Pseudogen behandelt wurde, war das kein Ligand bekannt war, bis kürzlich B7-H7 (HHLA2) als solcher identifiziert wurde [11]. Die B7 Proteinfamilie, welche zuerst auf B Zellen beschrieben wurde, umfasst eine Reihe von wichtigen immunologischen Rezeptoren. Darunter B7-1 (CD80), B7-2 (CD86) and B7-H1 (PDL1), welche alle für ihre T Zellregulation der adaptiven Immunantwort bekannt sind [12–15]. Zusätzlich enthält die Familie NK Zell Rezeptoren wie B7-H6, welcher NK Zellen via des NKp30 Rezeptors aktivieren kann [16]. Die vorgelegte Dissertation versucht zusätzliche Interaktionen von KIR und B7 Protein mittels eines proteinbasierten Hochdurchsatzscreens zu identifizieren (HTS). Weiterhin werden gefundene Interaktionspartner durch zellbasierte Bindungsexperimente und Zelltoxizitätsexperimente auf ihre biologische Funktion hin untersucht. Im letzten Schritt werden die Interaktionspartner im humanen System auf ihre Interaktion hin untersucht. Insgesamt konnte mit dem HTS die bereits bekannten Interaktionen von KIR3DL3 & B7-H7, sowie NKp30 & B7-H6 und eine neue Interaktion zwischen KIR3DL2 & B7-H1 (PDL1) identifiziert werden, wobei letztere auf zellulärer Basis nicht bestätigt werden konnte. Die folgenden Experimente fokussierten sich daher auf das Zusammenspiel von KIR3DL3 & B7-H7 und bestätigten die inhibitorische Funktion der Interaktion. Zusätzlich konnte Blut als humanes Kompartiment identifiziert werden, in dem beide Rezeptoren vorhanden sind. Zusammenfassend stellt die Dissertation dar, dass die Funktion des KIR3DL3 Rezeptors und der ihn exprimierenden Zellen immer noch nahezu unverstanden ist. Zudem ist nicht zu erkennen, warum der Rezeptor evolutionär konserviert ist, obwohl er nahezu nicht auf der Oberfläche präsentiert wird. Zukünftige Arbeiten werden sich damit befassen müssen, welche Auswirkungen ein Verlust des KIR3DL3 Rezeptors hat. Zudem wird es von besonderer Bedeutung sein, die Rolle der KIR3DL3 & B7-H7 Interaktion in viralen oder bakteriellen Krankheiten zu verstehen, da beide Rezeptoren auf wichtigen immunologischen Zellgruppen vorhanden sind. Bisher weiß man lediglich, dass B7-H7 in diversen Krebsarten überexprimiert wird, wie zum Beispiel in Nierenkrebs, akut lymphatischer Leukämie, nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen, Gallenblasenkrebs und Magenkrebs und dies meist unabhängig vom immunologischen Checkpoint Molekül B7-H1 (PD-L1), welches schon lange in erfolgreich in der Krebstherapie eingesetzt wird [11, 17–26]. Ein paar der Antworten zu eben jenen Fragen, werden auch durch klinische Studien beantwortet werden, wie zum Beispiel die Phase I Studien zu den monoklonalen Antikörpern NPX267 und HBM1020, die sich gegen die KIR3DL3 & B7-H7 Interaktion richten.