Photocages for time-resolved X-ray crystallography

Abstract

Die zeitaufgelöste Röntgenkristallographie ist ein aufstrebendes Forschungsgebiet, das die Vorteile der jüngsten Fortschritte in der Detektortechnologie und der hochbrillanten Röntgenquellen von Synchrotrons und Freie-Elektronen-Lasern nutzt. Herausfordernd ist dabei die Anpassung der makromolekularen Kristallographie an einen zeitaufgelösten Experimentiermodus, dessen Hauptforschungsschwerpunkte unter anderem darin liegen, wie die Reaktion im Kristall ausgelöst werden kann. Ein Ansatz zur schnellen und genauen Reaktionsinitiierung im Kristall ist die Bestrahlung der Probe mit Laserlicht. Jedoch reagieren die meisten Proteine nicht von Natur aus auf diese Lichtanregung. Dies kann durch die Einführung von photolysierbaren Verbindungen, sogenannten Photocaging-Gruppen, in das Protein oder sein Substrat erreicht werden. Daher ist es wichtig, neue Photocagetypen für den Einsatz in der zeitaufgelösten Strukturbiologie zu erzeugen und zu charakterisieren. In diesem Projekt wurden eine Reihe von α-Carboxynitrobenzyl-Photocages synthetisiert und mit L-Aspartat verbunden. Die caged-Aspartatverbindugnen waren wasserlöslich, mit hydrolytischen Halbwertszeiten von 10 − 29 h, die sie für eine Reihe von biologischen Anwendungen geeignet erscheinen lassen. Die Quantenausbeute der Aspartatfreisetzung lag zwischen 0,05 und 0,14. α-Carboxynitrobenzyle sind chiral, und ihre Kopplung an L-Aspartat führt bei Verwendung eines Racemats zu einem diastereomeren Gemisch. Einige enantioselektive Routen wurden vorgeschlagen, scheiterten aber letztlich. Stattdessen wird die chirale Auflösung, anstatt chiraler Kontrolle, als ein Weg für zukünftige Arbeiten präsentiert. Mit der zeitaufgelösten UV-Vis-Spektroskopie wurde die Kinetik der α-Carboxynitrobenzyl-Photoreaktionen untersucht. Wichtige Aci-Nitro-Zwischenprodukte wurden mit Zeitkonstanten von 1 − 10 µs oder 1 ms, abhängig von den aromatischen Substituenten, beobachtet. Sub-Nanosekunden-Transienten von 450 fs und 1 ps wurden für α-Carboxy-6-nitropiperonylazetat beobachtet, die auf Schwingungsrelaxation bzw. die S1-Lebensdauer zurückzuführen sind.

Time-resolved X-ray crystallography is an emerging research field that takes advantage of recent developments in detector technology and high-brilliance X-ray sources from synchrotrons and X-ray free-electron lasers. Adapting macromolecular crystallography to a time-resolved experimental mode is challenging, with reaction initiation in crystallo a key element that must be addressed. One approach that allows for rapid and accurate triggering of a reaction within a crystal uses laser light irradiation. However, most proteins may not inherently respond to light-initiation. This can be addressed by the introduction of photocaging groups into either the protein or its substrate. Therefore, it is important to both generate and characterise new photocage types for application in time-resolved structural biology. In this project, a number of α-carboxynitrobenzyl photocages were synthesised and joined to L-aspartate. The caged aspartates were water soluble, with hydrolytic half-lives of 10 − 29 h, making them suitable for a range of biological applications. The quantum yields of aspartate release ranged from 0.05 to 0.14. α-Carboxynitrobenzyls are chiral, and their coupling to L-aspartate results in a diastereomeric mixture if a racemate is used. Some enantioselective routes were proposed but failed. Chiral resolution, rather than chiral control, is suggested as an avenue for future work. Time-resolved UV-Vis spectroscopy was used to investigate the kinetics of the α-carboxynitrobenzyl photoreactions. Key aci-nitro intermediates were observed with time constants of 1 − 10 µs or 1 ms, depending on the aromatic substituents. Sub-nanosecond transients were observed for α-carboxy-6-nitropiperonyl acetate: 450 fs and 1 ps, attributed to vibrational relaxation and S1 lifetime, respectively.