Hitzeschockprotein 60 (Hsp60) als immunologischer Signalverstärker in der Maus (Mus musculus)

Abstract

Eukaryontische Hitzeschockproteine (HSP) werden seit einiger Zeit als endogene Gefahrensignale diskutiert. Neben seiner klassischen Funktion als molekulares Chaperon in den Mitochondrien besitzt Hsp60 ebenfalls immunstimulatorische Funktionen. Die Gegenwart von Hsp60 führt in vitro zu einer Aktivierung von antigenpräsentierenden Zellen (APZ) und T-Zellen, wie sie auch durch bakterielles LPS stimuliert wird. Beide Moleküle scheinen dabei denselben Rezeptorkomplex aus CD14 und TLR4 zu nutzen und deshalb sehr ähnliche Effekte zu induzieren. Für die bislang durchgeführten Studien wurde jedoch bakteriell exprimiertes rekombinantes Hsp60-Protein verwendet, das mit bakteriellen PAMP, insbesondere LPS, kontaminiert war. Trotz der durchgeführten Kontrollen konnte die immunstimulatorische Wirkung von Hsp60 und LPS sowie anderen PAMP nicht eindeutig differenziert werden. In dieser Arbeit wurde deshalb die immunmodulatorische Aktivität des Hsp60-Proteins bei der Stimulation von APZ sowie der antigenabhängigen T-Zellaktivierung in einem vollständig Endotoxin-freien in vitro-Testsystem analysiert unter Verwendung Hsp60-exprimierender eukaryontischer Zellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit haben gezeigt, dass Hsp60 über eine intrinsische immunstimulatorische Aktivität verfügt, die bei der antigenabhängigen Aktivierung naiver T-Zellen zu einer gesteigerten Freisetzung des TH1-Zytokins IFNgamma führt. Diese Funktion des Hsp60-Proteins ist entgegen früheren Beobachtungen unabhängig von den von APZ produzierten Zytokinen IL-6, IL-12, IL-23 und TNFalpha, deren Freisetzung, ebenso wie die Expression der kostimulatorischen B7-Moleküle B7.1 (CD80) und B7.2 (CD86), durch Hsp60 in APZ nicht induziert wird. Im Gegensatz hierzu führt die Stimulation von APZ mit bakteriellem LPS sowohl zur Produktion großer Mengen IL-6, IL-12 und TNFalpha als auch zu einer gesteigerten Expression von B7.1 und B7.2. Die LPS-induzierte Stimulation der IFNgamma-Freisetzung in T-Zellen ist außerdem strikt abhängig von IL-12 und TNFalpha. Die in früheren Studien beobachtete Zytokinfreisetzung bei der Stimulation von APZ mit rekombinantem Hsp60 ist aufgrund dieser Ergebnisse wahrscheinlich auf Kontaminationen der Proteinpräparationen mit bakteriellen sogenannten Pathogen-assoziierten molekularen Mustern (PAMP) wie LPS zurückzuführen. Darüber hinaus wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass Hsp60 im Gegensatz zu LPS unabhängig von funktionellem Toll-like-Rezeptor 4 (TLR4) und dem TLR-assoziierten MyD88-Signalweg die IFNgamma-Produktion in T-Zellen steigern konnte. TLR4 und auch andere TLR sind deshalb an der Hsp60-vermittelten Immunstimulation wahrscheinlich nicht beteiligt. Hsp60 und LPS nutzen folglich offenbar unterschiedliche Signaltransduktionswege. Bei der Hsp60- vermittelten T-Zellstimulation ist dabei möglicherweise das Typ I-Interferon IFNalpha von Bedeutung. Die Relevanz der in vitro beobachteten immunstimulatorischen Aktivität des Hsp60- Proteins wurde schließlich in vivo überprüft. Die Expression des Hsp60-Proteins auf der Zelloberfläche von Tumorzellen führte in vivo zu einer gesteigerten Immunogenität derTumorzellen und einer verbesserten Tumorabwehr, die möglicherweise auf eine unspezifische, durch die spontane Freisetzung von IFNgamma und IL-2 gekennzeichnete, Aktivierung des Immunsystems zurückzuführen ist. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass Hsp60 immunstimulatorische Eigenschaften besitzt, die dieses HSP als endogenes Gefahrensignal und immunologischen Signalverstärker kennzeichnen.

Eukaryotic heat shock proteins (HSP) are discussed to function as endogenous danger signals. Hsp60 is a mitochondrial chaperon that also possesses immunological functions. Similar to bacterial LPS recombinant Hsp60 induces cytokine production in APC like macrophages and dendritic cells and stimulates antigen dependent T cell activation. Both, LPS and Hsp60, seem to use the same signalling pathways mediated by engagement of the CD14/TLR4 receptor complex. However, since recombinant Hsp60 that had been expressed in bacteria was used in previous studies it was difficult to dissect Hsp60 mediated effects from LPS mediated stimulation because LPS was also present in the protein preparations. In this study an endotoxin-free in vitro test system was established using Hsp60 expressing eukaryotic cell lines to analyze immunological functions of Hsp60. The results of this study show that Hsp60 does not induce cytokine production as well as expression of costimulatory B7 molecules in APC and that stimulation of IFNgamma production in T cells by Hsp60 was independent of IL-6, IL-12, IL-23 and TNFalpha. In contrast LPS mediated IFNgamma induction was strictly dependent on IL-12. Furthermore, the TLR4 receptor and the TLR associated MyD88 signalling pathway were not necessary for Hsp60 mediated T cell stimulation. Therefore, Hsp60 and LPS obviously use different signalling mechanisms to mediate immune stimulation. In vivo Hsp60 that was expressed on the cell surface of tumor cells lead to an increase in tumor immunogenicity and prolonged tumor survival. Hsp60 mediated immune stimulation in vivo was characterized by an unspecific spontaneous secretion of IFNgamma and IL-2. Taken together these results show that Hsp60 possesses an intrinsic immunomodulatory potential that charakterizes this protein as an immunological signal enhancer.