Nitroxyl-Donoren: PKGIα als neue therapeutische Zielstruktur

Abstract

Die systemische arterielle Hypertonie ist eine weltweit verbreitete kardiovaskuläre Erkrankung, die zu Organschäden und Schlaganfall bzw. Herzinsuffizienz mit Todesfolge führen kann. Trotz vielfältiger Kombinationstherapien wird nach neuen Medikamenten gesucht, die selbst in therapierefraktären Patient*innen effektiv den Blutdruck senken können. Eine vielversprechende therapeutische Alternative zu den verfügbaren Medikamenten, wie Stickstoffmonoxid (NO)-Donoren oder anderen Vasodilatoren, könnte Nitroxyl (HNO) sein. HNO ist die ein-Elektron-reduzierte und protonierte Form von NO, welche eine vasorelaxierende und positive inotrope Wirkung zeigt, jedoch ohne eine Toleranzentwicklung auszulösen. Die HNO-induzierten oxidativen Modifikationen in der cGMP-abhängigen Proteinkinase Iα (PKGIα) und die daraus resultierende Intradisulfidbrückenbildung zwischen den Cysteinen 117 und 195 in der hochaffinen cGMP-Bindedomäne wurden als ein wichtiger Mechanismus für die Regulation der Kinase unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen postuliert. Der individuelle Beitrag der beiden Cysteine ist jedoch nicht vollständig aufgeklärt. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, die HNO-induzierte Intradisulfidbrückenbildung und den individuellen Beitrag der Cysteine 117 und 195 sowie ihre funktionelle Relevanz zu charakterisieren. Dies wurde mit verschiedenen Verfahren untersucht: (i) PKGIα-basierte Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) Biosensoren für cGMP-Bindung und Konformationsänderung; (ii) In vitro Kinase Assays; (iii) Messungen der VASP Phosphorylierung in isolierten aortalen vaskulären glatten Gefäßmuskelzellen (VSMCs) (iv) Vasorelaxationsmessungen der Arteria femoralis in neu generierten Knockin (KI)-Mausmodellen. Hierzu wurden mittels molekularer Klonierung FRET-Sensoren und mittels CRISPR/Cas9 Technologie drei neue Mauslinien hergestellt, bei denen das Cystein 117 oder 195 bzw. beide gleichzeitig zu nicht oxidierbarem Serin (C117S, C195S, C117/195S) ausgetauscht wurden. Der experimentelle HNO-Donor 1-Nitrosocyclohexylacetat (NCA) und der klinisch relevante Donor CXL-1020 wurden dabei zur Stimulation der Zellen und Gefäße eingesetzt. Beide HNO-Donoren induzierten in FRET-Experimenten eine aktivatorische Oxidation der löslichen Guanylylcyclase (sGC), die durch den prototypischen sGC Inhibitor 1H-(1,2,4)-Oxadiazolo-(4,3-a)-chinoxalin-1-on (ODQ) aufgehoben werden konnte. Die direkte Oxidation durch HNO in Gegenwart von ODQ führte vergleichbar wie die cGMP-Bindung zu einer Konformationsänderung der Sensoren. Dabei waren die FRET-Effekte in allen Mutanten, außer nach NCA Stimulation bei C195S, signifikant reduziert. Obwohl die in vitro Kinase Assays eine gleichermaßen reduzierte PKGIα Aktivität aufgrund der fehlenden Intradisulfidbrückenbildung in allen Mutanten zeigten, waren die CXL-1020 stimulierte VASP Phosphorylierung in aortalen VSMCs und Vasorelaxation der Arteria femoralis isoliert aus den Prkg1-C117S und Prkg1-C195S KI-Mäusen unauffällig. Hingegen zeigten Prkg1-C117/195S Mäuse neben einer ausgeprägten Splenomagalie und einem dramatischen gastrointestinalen Phänotyp eine signifikant verminderte NCA und CXL-1020 induzierte VASP-Phosphorylierung. Beide Cysteine 117 und 195 sind daher unentbehrlich für die oxidativ induzierte und aktivatorische Intradisulfidbrückenbildung, wogegen einzeln mutierte Cysteine durch unterschiedliche Mechanismen kompensiert werden können. Die oxidative Aktivierung ist somit neben der klassischen cGMP-abhängigen Aktivierung ein wichtiger und unverzichtbarer Prozess für die physiologische Funktion der PKGIα in vivo.