Enriching the diversity of polyethylene terephthalate degrading enzymes from metagenomes

Abstract

Polyethylenterephthalat (PET) ist ein langlebiger, chemisch und thermisch stabiler Polyester. Aufgrund dieser wünschenswerten Eigenschaften wird PET in zahlreichen Anwendungen unseres Alltags eingesetzt. Allerdings zersetzen sich PET-Kunststoffe, wenn sie in die Umwelt freigesetzt werden, nur in geringem Maße. Daher ist seine Anreicherung sowohl in den Ozeanen als auch an Land zu einem der Hauptprobleme der Plastikverschmutzung geworden. Im Vergleich zu herkömmlichen PET-Recyclingprozessen, die viele Energiequellen erfordern und in der Regel schädliche Schadstoffe produzieren, bietet die Verwendung von mikroorganismengenerierten Enzymen eine neuartige, umweltfreundliche Option zur Beseitigung von Plastikabfällen. Bisher wurden nur wenige bakterielle Hydrolasen und Mikroorganismen mit der Fähigkeit identifiziert, synthetische Polymere abzubauen, wobei ihre Abbauaktivitäten für einen industriellen Einsatz relativ gering sind. Darüber hinaus hat die bioinformatische Analyse gezeigt, dass das Phylum der Bacteroidetes das Potenzial zum PET-Abbau besitzt, wenngleich bislang kein Enzym, das diesem Phylum zugeordnet ist, funktionell verifiziert werden konnte. Das Hauptziel der vorliegenden Studie bestand daher darin, ein besseres Verständnis der molekularen Mechanismen zu erlangen, die am mikrobiellen Abbau von PET beteiligt sind, und die Biodiversität der Enzyme, die in der Lage sind, dieses komplexe Polymer abzubauen, zu erweitern. Um neuartige PET-aktive Enzyme zu identifizieren, wurden dreißig Kandidatengene, die putative PETasen kodieren und mittels einer auf Hidden-Markov-Modellen basierenden Suche (HMM-Suche) identifiziert wurden, synthetisiert. In Kombination mit funktionellen Screening-Methoden wurden drei Enzyme – PET27, PET30 und PET40 – identifiziert, die in der Lage sind, PET abzubauen. PET27 und PET30, die dem Phylum Bacteroidetes zugeordnet sind, zeigten eine hydrolytische Aktivität gegenüber PET und lieferten somit den ersten funktionellen Nachweis für die Beteiligung dieses Phylums am PET-Abbau. Weitere Untersuchungen zeigen, dass PET30 selbst bei 4°C signifikante Aktivitäten gegenüber PET und p-Nitrophenylhexanoat (pNP-C6) aufweist. Zudem wurden alle drei Enzyme detailliert charakterisiert. Die gewonnenen Ergebnisse belegen, dass die Enzyme in der Lage sind, eine Vielzahl von Substraten zu hydrolysieren, darunter das Polymer Polycaprolacton (PCL), das PET-Monomer Bis-(2-hydroxyethyl)terephthalat (BHET) und das Polyesterpolyurethan Impranil@DLN. Obwohl die beobachteten Abbauraten von PET relativ gering waren, kann angenommen werden, dass die PET-Hydrolyse eine Nebenreaktion infolge ihrer Aktivität auf verschiedene Substrate darstellt, was auf die Promiskuität dieser Enzyme hinweist. Darüber hinaus wurden Kristallisations- und Bindungsstudien an PET30 und PET40 durchgeführt, welche strukturelle Einblicke in die an den Abbauprozessen beteiligte Substratbindungsstelle lieferten. Die Analyse der globalen Verbreitung von PET27, PET30 und ihren Homologen ergab, dass vielversprechende Enzymkandidaten, die dem Phylum Bacteroidetes zugeordnet sind, in unterschiedlichen Klimazonen vorkommen. Der Großteil dieser Enzyme ist mit aquatischen Metagenomen assoziiert, was auf einen potenziell positiven Einfluss auf die Kunststoffhydrolyse in marinen Umgebungen hindeuten könnte. Zusammenfassend liefert diese Arbeit detaillierte biochemische Charakterisierungen der neuartigen PET-aktiven Enzyme und erweitert das Wissen über die zugrunde liegenden Mechanismen auf struktureller Ebene. Die präsentierten Ergebnisse ermöglichen ein besseres Verständnis des mikrobiellen Abbaus im Allgemeinen und bereichern die Biodiversität der PET-hydrolysierenden Enzyme.