Die Funktion einer E3 Ubiquitin-Ligase in der Bildung von Membran-Membran-Kontaktflächen

Abstract

Die pflanzliche Immunantwort ist präzise reguliert, sodass selbst geringfügige Veränderungen die Fitness einer Pflanze erheblich beeinflussen können. In diesem Zusammenhang spielen Ubiquitin-Ligasen, wie die SENESZENZ-ASSOZIIERTE E3 UBIQUITIN-LIGASE 1 (SAUL1), eine zentrale Rolle bei der Regulation von stressinduzierten Reaktionen in Arabidopsis thaliana. Während Temperaturen unter 23 °C eine Autoimmunantwort in saul1-1 knock-out Pflanzen induzieren, zeigen diese Pflanzen, durch eine konstitutive basale Immunantwort, bei 25 °C eine erhöhte Resistenz gegenüber bakteriellen Infektionen. Der genaue Mechanismus, durch den SAUL1 die pflanzliche Immunantwort reguliert, ist jedoch bisher ungeklärt. In dieser Arbeit wurden strukturelle Modifikationen am SAUL1-Protein vorgenommen, um die Funktionalität der rekombinanten Proteine zu untersuchen. Insbesondere wurde die Affinität der Armadillo-like Domäne 7-11 zur Plasmamembran untersucht, indem verkürzte Teildomänen generiert und untersucht wurden. Dabei wurde gezeigt, dass die vollständige ARM7-11 Domäne für die Lokalisation von SAUL1 an der Plasmamembran notwendig ist. Darüber hinaus wurden gezielte Modifikationen in der positiv geladenen Region dieser Domäne durchgeführt. Hierbei wurden die drei Arginine R736, R737 und R775 durch die ungeladene Aminosäure Alanin, das positiv geladene Lysin oder die negativ geladene Glutaminsäure ausgetauscht. R736 trägt eine entscheidende Rolle bei der Lipid-Lipid-Interaktion von SAUL1. Im Vergleich zu GFP-SAUL1 war GFP-SAUL1R736A nicht in der Lage Membranflecken zu bilden. Dieses Phänomen wurde mithilfe von einfach, zweifach und dreifach punktmutierten SAUL1 in A. thaliana Mesophyllprotoplasten untersucht. Dabei konnte eine Dynamik der Membranflecken, ihre Induzierbarkeit sowie eine scheinbar konzentrationsabhängige Bildung von SAUL1-Vesikeln festgestellt werden. Für in vivo Experimente wurden transgene Arabidopsis thaliana Pflanzen mit den generierten Arginin zu Alanin Punktmutanten erstellt und sowohl phänotypisch als auch mikroskopisch untersucht. Das rekombinante Protein SAUL1R736A wurde exprimiert, aufgereinigt und mittels CD-Spektroskopie mit dem Wildtyp-Protein SAUL1 verglichen, wobei keine strukturellen Unterschiede festgestellt wurden. Anschließend wurden beide rekombinanten Proteine für Protein-Lipid-Interaktionsexperimente verwendet, bei denen eine Affinität von SAUL1 zu spezifischen Plasmamembranlipiden sowie Lipiden der Phosphatidylinositol-Familie nachgewiesen werden konnte.