The Influence of Cytoadhesion of P. falciparum Infected Erythrocytes on Human Lung Endothelial Cells

Abstract

Malaria ist eine der relevantesten Infektionskrankheiten weltweit und Plasmodium falciparum ist ihr wichtigster Erreger. P. falciparum Malaria verursacht hohe Sterblichkeitsraten, besonders in Risikogruppen wie Schwangere und Kleinkinder. P. falciparum kann dem Immunsystem ausweichen und an Endothelzellen in wichtigen Organen binden und in die Zellen sequestrieren. In den Lungen kann der Parasit ein Lungenödem und ein akutes Atemnotsyndrom verursachen. Die Bindung von infizierten Erythrozyten an Endothelzellen wird durch einen Parasitenliganden und seinen humanen Endothelrezeptor vermittelt. Der wichtigste bisher erforschte parasitäre Ligand ist PfEMPF1, welcher von der var Genfamilie kodiert wird. Es konnte gezeigt werden, dass P. falciparum in der Lage ist einen Antigenwechsel zu einem einzigen exprimierten var Gen durchzuführen, um auf diese Weise dem Immunsystem zu entkommen und die Bindung mittels PfEMP1 anzupassen. Wichtige dazu passende humane Gewebsrezeptoren sind unter anderem ICAM-1, CD36 und EPCR. Die Blutgefäße und das Lungengewebe reagieren auf die Infektion mit einer Aktivierung des Immunsystems, einer gestörten Homöostase und einer endothelialen Dysfunktion. Die hier präsentierte Studie strebt ein besseres Verständnis über die Wirkung der Zytoadhäsion von mit P. falciparum infizierten Erythrozyten an humanen Lungenendothelzellen an. Hierfür wurden drei Versuchsschritte durchgeführt: Als Erstes wurden mit P. falciparum infizierte Erythrozyten über HULEC-5a und HMVEC-L angereichert und deren Transkriptom auf einen Antigenwechsel des var Gens hin untersucht. Für die HULEC-5a Zellreihe waren die Ergebnisse nicht aussagekräftig. Bei der HMVEC-L Zellreihe zeigten sich fünf var Gene in ihrer Expression signifikant erhöht. Als Zweites wurden HMVEC-L gemeinsam mit infizierten Erythrozyten für vier bzw. acht Stunden inkubiert und anschließend deren isolierte RNA sequenziert, um Veränderungen in den Genexpressionslevels zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten veränderte Expressionslevels für viele Gene und eine Immunsystemaktivierung deutete sich durch erhöhte Expressionen von EGR1 und HMOX1 an. Allerdings wurden relevante Genfamilien wie Interleukine, ICAMs, TNFSFs, CXCLs, NFκBs und EPOR durch die gemeinsame Inkubation nicht signifikant stimuliert. Als Drittes wurden HMVEC-L mit TNF stimuliert und die exprimierten Rezeptoren mittels FACS identifiziert. Hier zeigten die Ergebnisse einerseits eine hohe Anzahl von ICAM-1, was ein möglicher Ligand bei Entzündungsprozessen in den Lungen ist und andererseits auch eine hohe Anzahl von CSA, was möglicherweise ein protektiver Faktor für die Lunge ist. Abschließend betrachtet erscheint der Versuchsaufbau erfolgreich, wobei einige Ergebnisse nicht beweiskräftig waren. Die Experimente sollten mit Zellen von einem anderen Spender wiederholt werden, um so die hier präsentierten Ergebnisse zu überprüfen und die wichtige Erforschung des Pathomechanismus von Malaria in der Lunge fortzusetzen.

Malaria is one of the most relevant infectious diseases around the world and P. falciparum is its most relevant causing parasite with high mortality rates especially in risk groups such as pregnant women and young children. P. falciparum has the skillset to evade the immune system and to cytoadhere and to sequester in endothelial cells of vital organs such as brain and lungs. In the lungs, the parasite can cause oedema and lead to ARDS with poor clinical outcome. The cytoadhesion relies on the interaction between a parasite ligand and its corresponding human endothelial receptor. The main parasite ligand that has been identified so far is PfEMP1 which is encoded by the var genes, a family of about 60 genes. The parasite has been shown to perform an antigenic switch to a mutually expressed var gene to evade the human immune system and to adapt its binding mechanisms via PfEMP1. There are multiple important corresponding human endothelial receptors yet described such as ICAM-1, CD36, and EPCR. The affected blood vessels and the lung tissue react to the infection with P. falciparum with a stimulation of the immune system, an unsettled homeostasis, and an endothelial dysfunction. This study aimed at helping in better understanding the influence of cytoadhesion of P. falciparum infected erythrocytes on human lung endothelial cells. In order to achieve this aim, three steps were performed: First, P. falciparum infected erythrocytes were enriched over HULEC-5a and HMVEC-L and their transcriptome was analysed for the antigenic var gene switch. The results were inconclusive for HULEC-5a. For HMVEC-L five var genes were significantly overexpressed after enrichment. Second, lung primary cells (HMVEC-L) were co-incubated with iRBCs for four or eight hours and their isolated RNA was sequenced for changes in gene expression levels. The results showed changed levels for numerous genes and indicated immune activation by elevated expression of EGR1 and HMOX1, but overall the relevant gene families of interleukins, ICAMs, TNFSFs, CXCLs, NFκBs, and EPOR were not significantly stimulated by co-incubation. Third, the lung primary cells were stimulated with TNF and the expressed receptors were examined via FACS. Here, the results showed high numbers of ICAM-1, which is a potential activated ligand in inflammation and high numbers of CSA, which is a potential protector of lung tissue. In conclusion, the experimental setup appeared successful while some of the results were inconclusive. The experiments should be repeated with cell lines from another donor to confirm or challenge the outlined results and to continue the important investigation in the pathomechanism of lung malaria.