DC ElementWertSprache
dc.contributor.advisorUetrecht, Charlotte-
dc.contributor.advisorBosse, Jens-
dc.contributor.advisorSchlüter, Hartmut-
dc.contributor.authorGrün, Alice Frederike Rosa-
dc.date.accessioned2025-08-04T13:38:32Z-
dc.date.available2025-08-04T13:38:32Z-
dc.date.issued2025-
dc.identifier.urihttps://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/11844-
dc.description.abstractDas Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1) ist auf den Terminase-Komplex angewiesen. Dieser besteht aus den Proteinen pUL15, pUL28, pUL33 und packt die virale Desoxyribonukleinsäure (DNS) in das Prokapsid während der Replikation. Trotz ihrer Bedeutung als antivirales Ziel sind die Mechanismen, die die Terminase-DNA-Interaktionen steuern, nur unzureichend bekannt. Diese Arbeit untersucht die Stöchiometrie der HSV-1-Terminase und die Rolle des G-Quadruplexes, einer sekundären DNA-Struktur, bei der DNS-Protein-Komplexierung. Mittels nativer Massenspektrometrie wurde die Stöchiometrie des Terminase-Komplexes analysiert und es konnte gezeigt werden, dass virale G-Quadruplex-haltige DNS-Sequenzen nicht spezifisch an die Terminase binden. Während dieser Experimente wurden andere oligomerer Zustände des Terminase-Komplexes beobachtet, als vorherige Veröffentlichungen suggerierten. Anstelle der bisher publizierten Hexamere des heteromeren Trimer-Terminase-Komplexes wurden hauptsächlich Monomere, Dimere und Trimere beobachtet. Aus diesen Ergebnissen wurde ein Modell für ein neues Zwischenprodukt des Terminase-DNA-Komplexes während der Verpackung entworfen. Eine große methodische Herausforderung war die geringe Ausbeute und Qualität des gereinigten Terminase-Komplexes für die nMS-Analyse. Um dieses Problem zu lösen, wurde ein schnelles Proteinreinigungsprotokoll entwickelt, das den Proteinverlust minimiert und den zeitintensiven und verlustreichen Pufferaustauschschritt überflüssig macht. Dieser Ansatz, der mit dem Standardprotein Alkoholdehydrogenase (ADH) validiert und anschließend auf die Terminase und verwandte Proteine angewandt wurde, lieferte durchweg qualitativ hochwertige Proben, die für nMS geeignet sind. Die optimierte Methode bietet eine schnelle und effiziente Strategie für die Untersuchung verschiedenster Proteinkomplexe. Neben den Fragestellungen aus der HSV-Virologie wurde das Fast-Track-Protokoll auch eingesetzt, um die Neigung von fluoreszierenden Proteinen zur Dimerisierung zu untersuchen, die häufig in der Mikroskopie verwendet werden. Durch die Analyse ihrer Stöchiometrie mittels nativer Massenspektrometrie lieferte diese Arbeit systematische Einblicke in die Dimerisierung von FP unter nativen Bedingungen. Diese Erkenntnisse erleichtern die Auswahl von FPs für Mikroskopiestudien, um eine zuverlässige Einzelmolekülverfolgung zu ermöglichen. In dieser Arbeit werden Virologie, Massenspektrometrie und methodische Innovationen miteinander verknüpft, um das Verständnis des HSV-1-Verpackungsmechanismus zu verbessern. Hierzu wurden zunächst Arbeitsabläufe bei der Proteinreinigung für native Massenspektrometrie optimiert. Diese wurden außerdem verwendet, um geeignete fluoreszierende Proteine für die Fluoreszenzmikroskopie bezüglich ihrer Dimerisierung zu charakterisieren. Die Ergebnisse unterstreichen die Vielseitigkeit der nativen Massenspektrometrie, insbesondere in Kombination mit dem Fast-Track-Protokoll, bei der Untersuchung verschiedener biologischer Systeme und Proteinkomplexe.de
dc.description.abstractHerpes simplex virus 1 is dependent on the terminase complex. It consists of the proteins pUL15, pUL28, pUL33 and packs the viral DNA into the procapsid during replication. Despite its potential as an antiviral target, the mechanism of the terminase-DNA interaction is poorly understood. This work investigates the stoichiometry of the herpes simplex virus 1 terminase and the role of the secondary DNA structure G-quadruplex in the DNA-protein complex formation. Using native mass spectrometry, the stoichiometry of the terminase complex was analyzed and it was shown that viral G-quadruplex containing DNA does not bind specifically to the terminase. In these experiments, different oligomeric states of the terminase complex were observed than suggested in previous publications. Instead of hexamers of the heteromeric trimer terminase complex, mainly monomers, dimers and trimers were detected. Based on these results, a model for a new intermediate of the terminase-DNA complex during packaging was designed. A major experimental challenge was the yield and quality of the purified terminase complex being too low for native mass spectrometry analysis. To solve this problem, a fast-track protein purification protocol was developed that minimizes protein loss and eliminates the time-consuming and wasteful buffer exchange step. This approach, validated with the standard protein alcohol dehydrogenase and subsequently applied to terminase and related proteins, consistently yielded high-quality samples suitable for native mass spectrometry. The optimized method provides a rapid and efficient strategy for the analysis of a wide range of protein complexes. In addition to the studies on herpes simplex virus 1, the fast-track protocol was also used to investigate the tendency of fluorescent proteins, frequently used in microscopy, to dimerize. Through a stoichiometry analysis using native mass spectrometry, this work provided systematic insights into the dimerization of fluorescent proteins under native conditions. These findings facilitate the selection of fluorescent proteins for microscopy studies to ensure reliable single-molecule tracking. In this work, virology, mass spectrometry and method development are combined to improve the understanding of the herpes simplex virus 1 packaging mechanism. First, protein purification workflows were optimized for native mass spectrometry. These workflows were also used to characterize suitable fluorescent proteins for fluorescence microscopy in terms of their dimerization. The results underline the versatility of native mass spectrometry, especially in combination with the fast-track protocol, in the investigation of different biological systems and protein complexes.en
dc.language.isoende_DE
dc.publisherStaats- und Universitätsbibliothek Hamburg Carl von Ossietzkyde
dc.rightshttp://purl.org/coar/access_right/c_abf2de_DE
dc.subjectDNA-Protein-Komplexde
dc.subjectnMSde
dc.subjectAffinitätschromatographiede
dc.subject.ddc570: Biowissenschaften, Biologiede_DE
dc.titleCharacterizing the protein-DNA binding of the HSV-1 terminase by optimizing sample preparation for native mass spectrometryen
dc.title.alternativeCharakterisierung der Protein-DNA-Bindung der HSV-1-Terminase durch Optimierung der Probenvorbereitung für die native Massenspektrometriede
dc.typedoctoralThesisen
dcterms.dateAccepted2025-06-13-
dc.rights.cchttps://creativecommons.org/licenses/by/4.0/de_DE
dc.rights.rshttp://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/-
dc.subject.bcl35.26: Massenspektrometriede_DE
dc.subject.gndHerpes-simplex-Virusde_DE
dc.subject.gndMassenspektrometriede_DE
dc.subject.gndStrukturbiologiede_DE
dc.subject.gndVirologiede_DE
dc.subject.gndTerminasede_DE
dc.subject.gndG-Quadruplexde_DE
dc.type.casraiDissertation-
dc.type.dinidoctoralThesis-
dc.type.driverdoctoralThesis-
dc.type.statusinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionde_DE
dc.type.thesisdoctoralThesisde_DE
tuhh.type.opusDissertation-
thesis.grantor.departmentChemiede_DE
thesis.grantor.placeHamburg-
thesis.grantor.universityOrInstitutionUniversität Hamburgde_DE
dcterms.DCMITypeText-
datacite.relation.IsSupplementedByhttps://doi.org/10.1101/2025.02.22.639503de_DE
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:18-ediss-130406-
item.languageiso639-1other-
item.advisorGNDUetrecht, Charlotte-
item.advisorGNDBosse, Jens-
item.advisorGNDSchlüter, Hartmut-
item.fulltextWith Fulltext-
item.grantfulltextopen-
item.creatorGNDGrün, Alice Frederike Rosa-
item.creatorOrcidGrün, Alice Frederike Rosa-
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen
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