Isopeptidic Desferrioxamine Analogues: Solid Phase Synthesis and Evaluation of Zirconium Complexes

Abstract

This cumulative thesis contains of three publications and focuses the rational design and development of a new group of desferrioxamine B (DFOB) analogues aimed at improving 89Zr chelation for targeted PET imaging. The described limitations of DFOB and its octadentate analogue DFO* - particularly their suboptimal in vivo stability and solubility - form the foundation for the synthetic approaches developed herein. The objective was to create optimized chelators based on readily available building blocks, assembled into isopeptidic structures with tunable properties. Key structural features include four hydroxamic acids for efficient Zr4+ coordination, bifunctionalities for targeting vector conjugation, variable spacer lengths for fine-tuning complex stability, and clickable side chains for improved solubility and pharmacokinetic control. These criteria guided the development of a modular platform capable of addressing both the synthetic and functional limitations of previously available chelators. In the first publication (ChemMedChem, 2023) isopeptidic analogues of DFOB with azido side chains were synthesized. Termed AZA-DFO (hexadentate) and AZA-DFO* (octadentate), these chelators were constructed via modular synthesis from Orn-β-Ala and Lys-β-Ala. Nine chelators were further conjugated to zwitterionic moieties via copper-catalyzed azide–alkyne cycloaddition (CuAAC), resulting in water-soluble compounds capable of complexing Zr4+ under mild conditions (room temperature, 90 min). Transchelation studies using 1000-fold excess EDTA and 300-fold DFOB showed that shorter Orn-based hydroxamate spacing improves the complex stability compared to longer Lys-based variants. Notably, the arrangement of amide groups and presence of zwitterionic side chains did not impair complex stability. The octadentate AZA-DFO* derivative was identified as a particularly promising chelator, combining high stability and fast complexation kinetics with modularity for further functionalization. The second publication (European Journal of Organic Chemistry, 2024) describes a solid-phase synthesis strategy for isopeptidic DFOB and DFO* analogues (ipDFOB and ipDFO*) containing four hydroxamic acids for strong Zr4+ chelation. The approach utilizes commercially available or easily prepared Fmoc-protected precursors and enables synthesis of both ipDFO* and its clickable derivative AZA-ipDFO* in only a few hours. Compared to traditional multistep solution synthesis, the solid-phase method significantly reduces synthetic effort and enables modular assembly of chelators with adjustable spacer lengths. This flexibility is crucial for optimizing complexation properties, as the spacing between hydroxamates impacts complex stability with hard metal cations like Zr4+. This method thus represents a robust and scalable route for developing tailored chelators not only for Zr4+, but potentially for other clinically relevant radiometals. The third publication (ChemMedChem, 2024) reports the solid-phase synthesis of multiple octadentate DFOB analogues with varying hydroxamate spacers. The complex stabilities of these analogues by radiolabeling with 89Zr were evaluated both in human serum and in competitive assays with excess EDTA and DFOB. The radiochemical assay served as the benchmark for validating a non-radioactive LC/MS-based method. The data clearly demonstrated that longer hydroxamate spacing (9 atoms) results in higher stability, contradicting the results of the first publication. The most stable complex resisted EDTA challenge over 72 h, confirmed via both radio-TLC and LC/MS. The straightforward synthesis, high complex stability, and modular nature of these ipDFO derivatives highlight their potential as next-generation chelators for targeted PET imaging. One of the major challenges in this work was the synthesis of structurally complex, orthogonally protected building blocks. The approach involved side chain bearing amino acid derivatives such ornithine and lysine. These γ-standing amines of these compounds were oxidized via benzoyl peroxide to create a protected hydroxyl amine as an amine equivalent for the SPPS. As well non-side chain bearing compounds like γ-positioned bromo carbon acids like, 5-bromo pentanoic acid was used to synthesize non-side bearing chelators. Here substitution reactions with O-benzyl hydroxylamine leads to the corresponding intermediates for the usage in SPPS. In a third approach Boc-allylglycine was used to prepare intermediates via ozonolysis with followed reductive amination. For developing a solid-phase protocol the demanding coupling step of benzyl protected hydroxyl amine derivatives was optimized with respect to coupling reagents, equivalents, temperature, time, and resin choice. In summary, this work has enabled access to a new group of molecules with significant potential for clinical diagnostics, particularly in targeted PET, exemplified by the KuE-ipDFO* construct described in the second publication. The newly developed solid-phase synthesis (SPPS) strategy markedly reduces manual workload and facilitates the generation of clickable derivatives for targeted conjugation. The synthetic approach presented in this thesis demonstrates strong potential for full automation and exhibits robustness under conditions amenable to scale-up. The chelators introduced herein possess high flexibility for adaptation to a variety of novel applications.

Diese kumulative Dissertation beinhaltet drei Veröffentlichungen und befasst sich mit dem rationalen Design und der Entwicklung einer neuen Gruppe von Desferrioxamin B (DFOB)-Analoga, die die 89Zr-Chelatisierung für das targeted Positronen-Emissions-Tomographie (PET)-Imaging optimieren sollen. Die beschriebenen Einschränkungen von DFOB und seinem oktadentaten Analogon DFO* - insbesondere die suboptimale in vivo-Stabilität und Löslichkeit - bilden die Grundlage für den hier entwickelten synthetischen Ansatz. Ziel ist es, optimierte Chelatoren zu entwickeln, die auf leicht verfügbaren Bausteinen basieren und zu isopeptidischen Strukturen mit einstellbaren Eigenschaften zusammengesetzt werden. Zu den wichtigsten Strukturmerkmalen gehören vier Hydroxamsäuren für eine effiziente Zr4+-Koordination, Funktionalitäten für eine Konjugation der targeting Vektoren, variable Abstände zwischen den Hydroxamsäuren für ein fine tuning hinsichtlich der Komplexstabilität mit Zr4+ und clickbaren Seitenketten für eine verbesserte Löslichkeit und der Beeinflussung der Pharmakokinetik. Anhand dieser Kriterien wurde ein modularer Ansatz entwickelt, der sowohl die synthetischen als auch die funktionellen Einschränkungen der bisher verfügbaren Chelatoren überwinden kann. In der ersten Veröffentlichung (ChemMedChem, 2023) wurden isopeptidische Analoga von DFOB mit Azidoseitenketten synthetisiert. Diese Chelatoren mit den Bezeichnungen AZA-DFO (hexadentat) und AZA-DFO* (oktadentat) wurden durch eine modulare Synthese aus Bausteinen bestehend aus Ornithin-ß-Alanin (Orn-β-Ala) und Lysin-ß-Alanin (Lys-β-Ala) aufgebaut. Neun Chelatoren wurden durch kupferkatalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) an zwitterionische Moleküle konjugiert. Dies führte zu wasserlöslichen Verbindungen, die Zr4+ unter milden Bedingungen (Raumtemperatur, 90 Minuten) komplexierten. Experimente zu Transchelatierung mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)- und DFOB-Überschuss zeigten, dass die kürzeren Hydroxamatabstände auf Orn-Basis die Komplexstabilität im Vergleich zu längeren Varianten auf Lys-Basis verbessern. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die Anordnung der Amidgruppen und das Vorhandensein zwitterionischer Seitenketten die Stabilität der Komplexe nicht beeinträchtigten. Das oktadentate Orn-basierte AZA-DFO*-Derivat wurde als besonders vielversprechender Chelator identifiziert. Dieser vereint hohe Komplexstabilität und schnelle Komplexierungskinetik mit Modularität für weitere Funktionalisierungen. Die zweite Veröffentlichung (European Journal of Organic Chemistry, 2024) beinhaltet eine Festphasensynthesestrategie für isopeptidische DFOB und DFO*-Analoga (ipDFOB und ipDFO*), die vier Hydroxamsäuren für eine gute Zr4+-Chelatisierung enthalten. Der Ansatz verwendet leicht herzustellende Fmoc geschützte Vorstufen und ermöglicht die Synthese sowohl von ipDFO* als auch von clickbaren AZA-ipDFO* Derivaten in nur wenigen Stunden. Im Vergleich zur mehrstufigen liquid-phase Synthese reduziert die Festphasenmethode den Syntheseaufwand erheblich und ermöglicht den modularen Aufbau von Chelatoren mit einstellbaren Abständen zwischen Hydroxamaten. Diese Flexibilität ist entscheidend für die Optimierung der Komplexierungsstabilität, da der Abstand zwischen den Hydroxamaten die Stabilität des Komplexes mit harten Metallkationen wie Zr4+ beeinflusst. Diese Methode stellt somit einen robusten und skalierbaren Weg zur Entwicklung maßgeschneiderter Chelatoren nicht nur für Zr4+, sondern möglicherweise auch für andere klinisch relevante Radiometalle dar. Die dritte Veröffentlichung (ChemMedChem, 2024) beschreibt die Festphasensynthese mehrerer oktadentater DFO*-Analoga mit unterschiedlichen Hydroxamat-Abständen. Die Komplexstabilität dieser Analoga wurde durch Radiomarkierung mit 89Zr sowohl in Humanserum als auch in kompetitiven Assays mit EDTA und DFOB im Überschuss bewertet. Der radiochemische Assay diente dabei als Benchmark für die Validierung einer nicht-radioaktiven LC/MS-basierten Methode. Die Daten zeigten, dass ein längerer Hydroxamat-Abstand (9 Atome) zu einer höheren Stabilität führt, was den Ergebnissen der ersten Veröffentlichung auf den ersten Blick widerspricht. Der stabilste Komplex widerstand der EDTA-Kompetition über 72 Stunden, was sowohl durch Radio-Thin Layer Chromatography (TLC) als auch durch liquid chromatography gekoppelt an ein Massenspektrometer (LC/MS) bestätigt wurde. Die unkomplizierte Synthese, die hohe Komplexstabilität und der modulare Ansatz dieser ipDFO-Derivate unterstreichen ihr Potenzial als Chelatoren der nächsten Generation für das targeted PET-Imaging. Eine der größten Herausforderungen bei dieser Arbeit war die Synthese von strukturell komplexen, orthogonal geschützten Bausteinen. Der Ansatz umfasst Aminosäurederivate mit Seitenketten wie Ornithin und Lysin. Die γ-ständigen Amine dieser Verbindungen wurden mit Benzoylperoxid oxidiert, um ein geschütztes Hydroxylamin als Aminäquivalent für die solid phase peptide synthesis (SPPS) zu erzeugen. Auch nicht-seitenkettentragende Verbindungen wie γ-ständige Bromcarbonsäuren (bspw. 5-Brompentansäure) wurden zur Synthese von Chelatoren ohne Seitenkette verwendet. Hier führten Substitutionsreaktionen mit O-Benzylhydroxylamin zu den entsprechenden Intermediaten für die Verwendung in der SPPS. In einem dritten Ansatz wurde Boc-Allylglycin zur Herstellung von Kupplungsintermediaten über Ozonolyse mit anschließender reduktiver Aminierung verwendet. Für die Entwicklung eines belastbaren Festphasenprotokolls wurde der anspruchsvolle Kupplungsschritt von benzylgeschützten Hydroxylaminderivaten mit aktivierten Carbonsäuren im Hinblick auf Kupplungsreagenzien, Äquivalente, Temperatur, Zeit und Festphasenharz optimiert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit den Zugang zu einer neuen Gruppe von Molekülen mit erheblichem Potenzial für die klinische Diagnostik ermöglicht hat. Insbesondere für das targeted PET-Imaging könnten Verbindungen wie das in der zweiten Veröffentlichung präsentierte Lysin-Urea-Glutaminsäure (KuE)-ipDFO*-Konstrukt von höchstem Interesse sein, da es in einer Synthese die Herstellung vom targeting vector und Chelator in einer Verbindung ermöglicht. Die neu entwickelte Festphasensynthesestrategie reduziert den manuellen Arbeitsaufwand deutlich und erleichtert die Herstellung von klickbaren Derivaten für die gezielte Konjugation. Der in dieser Arbeit vorgestellte Syntheseansatz weist ein hohes Potenzial für eine vollständige Automatisierung auf und erweist sich als robust unter Bedingungen, die ein Scale-up ermöglichen