Phase Separation and Influenza A Virus: Disruption of Nuclear Biomolecular Condensates

Abstract

Das Influenzavirus A (IAV) repliziert im Zellkern infizierter Zellen, wo es auf eine hochorganisierte und durch membranlose Organellen strukturierte Umgebung trifft. Viele dieser nukleären Kompartimente, darunter Paraspeckles und das Nukleolus, entstehen durch flüssig-flüssig-Phasentrennung und spielen eine zentrale Rolle bei der Regulation der RNAVerarbeitung und Genexpression. Wie IAV mit diesen Strukturen interagiert oder sie umgestaltet, ist bisher nur unzureichend verstanden. In dieser Dissertation untersuche ich, wie IAV zwei nukleäre biomolekulare Kondensate – Paraspeckles und das Nukleolus – während der Infektion gezielt stört. Mittels in situ Crosslinking-Massenspektrometrie (SHVIP) identifiziere ich direkte physikalische Kontakte zwischen viralen Proteinen und nukleären RNA-Bindeproteinen, darunter zentrale Paraspeckle-Komponenten (NONO, SFPQ, PSPC1) sowie nukleoläre Faktoren (NCL, NPM1, FBL). Funktionelle Anschlussuntersuchungen – darunter Immunpräzipitationen, Mikroskopie, Replikationsassays und quantitative RNAAnalysen – zeigen, dass Paraspeckles aktiv durch IAV demontiert werden. Diese Störung erfolgt sowohl über direkte Interaktionen viraler Proteine mit Paraspeckle-Komponenten als auch durch den Abbau von NEAT1, einer langen nicht-kodierenden RNA, die als Gerüst der Paraspeckles dient. Während die Auflösung von Paraspeckles die virale Replikation fördert, indem sie zuvor sequestrierte Wirtsfaktoren mobilisiert, scheinen einige Paraspeckle-Proteine die virale Genexpression auch direkt zu unterstützen. Parallel dazu zeige ich, dass IAV die Organisation des Nukleolus verändert und die ribosomale RNA-Biogenese stört. Insbesondere führt die Infektion zu einer Umverteilung von Prä-rRNA-Spezies, zur Bildung nukleoplasmatischer rRNA-Punkte und zu einem charakteristischen Block in der Reifung der 18S rRNA. Dieses Phänomen steht im Zusammenhang mit einer direkten Interaktion zwischen Nukleolin (NCL) und dem viralen Nukleoprotein (NP), belegt durch Bildgebung, Ko-Immunpräzipitation und Domänenkartierung. Die Störung der Ribosomenbiogenese geht mit einer Fragmentierung des Nukleolus einher und könnte eine Strategie des Virus darstellen, die zelluläre Translationskapazität gezielt zu modulieren. Insgesamt identifiziert diese Arbeit nukleäre, phasenseparierte Organellen als zentrale Ziele der viralen Reprogrammierung und zeigt, dass ihre Auflösung ein aktiver, mehrschichtiger Bestandteil des IAVReplikationsprogramms ist. Durch die Kombination von Interaktomik, Bildgebung und funktioneller Virologie leistet diese Dissertation einen Beitrag zum besseren Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Virus und nukleärer Architektur.