Dissecting the dynamics of cell death pathways in Hirschsprung's Disease: A comparative analysis of viable and non-viable cells under proinflammatory conditions

Abstract

Background:Hirschsprung’s disease (HSCR) is a congenital disorder of the enteric nervous system that predisposes patients to severe inflammatory complications, such as Hirschsprung-associated enterocolitis (HAEC). Method:In this study, we employed a novel flow cytometry-based assay to investigate the dynamics of cell death in colonic organoids from HSCR patients and matched controls subjected to acute and chronic inflammatory stimuli. Main Result:Using this approach, we quantified three distinct types of programmed cell death — RIPK1-dependent apoptosis, RIPK1-independent apoptosis, and necroptosis—in both viable and non-viable cells. Our data revealed that HSCR organoids exhibited a significantly increased susceptibility to acute inflammation, with elevated rates of cell death compared to controls. In contrast, chronic stimulation induced a regulatory shift from RIPK1-dependent to RIPK1-independent apoptosis, particularly in non-viable HSCR cells.These results, derived from patient-specific organoid models, provide insight into the epithelial stress response in HSCR. Conclusion:These findings suggest altered inflammatory signaling in HSCR and highlight the central role of RIPK1 in regulating epithelial cell fate, and may guide the development of targeted therapeutic strategies for preventing HAEC in patients with HSCR.

Unsere Studie zeigt, wie organ-spezifisch Organoide bei Morbus Hirschsprung (HSCR) auf akute und chronische Entzündungsreize reagieren. Dabei konnten wir mittels eines neu etablierten FACS-basierten Assays unterschiedliche Formen des programmierten Zelltods (RIPK1-abhängige und -unabhängige Apoptose sowie Nekroptose) in lebenden und toten Zellen identifizieren und analysieren. Unter akuter Stimulation zeigten HSCR-Organoide eine erhöhte Zellsterblichkeit im Vergleich zu Kontrollen. Bei chronischer Stimulation kam es zu einer Verschiebung der Zelltodmechanismen: Während die RIPK1-abhängige Apoptose abnahm, nahmen alternative Signalwege – insbesondere RIPK1-unabhängige – zu. Diese dynamische Umstellung lässt auf eine adaptive, jedoch gestörte epithelial immunologische Antwort schließen. RIPK1 fungiert dabei als zentraler Regulator zwischen immunologisch stiller Apoptose und entzündungsfördernder Nekroptose. Die Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung dieses Signalwegs im epithelialen Stressverhalten und liefern neue Hinweise auf krankheitsspezifische Besonderheiten bei HSCR. Diese Erkenntnisse könnten dazu beitragen, pathologische Entzündungsreaktionen bei HSCR besser zu verstehen und neue therapeutische Ansätze zur Prävention von HAEC zu entwickeln.