An investigation into the immunometabolic control of brown and white adipose tissue by efferocytic macrophages

Abstract

Summary: Upon exposure to cold temperatures or during times of energy shortage, the body initiates complex adaptive responses to maintain thermal and energy homeostasis. A critical component of these responses is the activation of the sympathetic nervous system, which leads to the local release of norepinephrine (NE) in adipose tissue. NE, in turn, acts on adrenergic receptors on adipocytes to stimulate thermogenesis and lipolysis. In particular, brown adipose tissue (BAT) is well known for its thermogenic capacity, but also subcutaneous white adipose tissue (WAT) can adopt a thermogenic (beige) phenotype upon prolonged cold stimulation. Activation of brown and beige adipose tissue is actively explored as a therapeutic strategy for obesity and metabolic syndrome, due to their roles in enhancing energy expenditure and improving insulin sensitivity. Sustained thermogenic activity thereby requires significant structural remodeling of adipose tissue, including changes to the extracellular matrix and expansion of tissue innervation and vascularization. Macrophages play a central role in these remodeling processes through their ability to perform efferocytosis - the clearance of dying cells. This process can induce a specialized, anti-inflammatory/tissue-remodeling profile in the efferocytic macrophages, mainly driven by the engagement of the two efferocytic receptors AXL and MERTK. Interestingly, impaired efferocytic function of adipose tissue macrophages has been linked to metabolic disorders such as type 2 diabetes, but its role in thermogenic activation of adipose tissue remains unexplored. In this study, we used cold exposure to induce thermogenic remodeling of adipose tissue and explored the role of macrophage efferocytosis during this process. We found that F4/80⁺CD11b⁺ macrophages isolated from the interscapular iBAT (iBAT) and inguinal WAT (ingWAT) of cold-housed C57BL/6 mice exhibited significantly higher efferocytic capacity compared to those from thermoneutral-housed controls. This enhanced efferocytosis was associated with the accumulation of ATMs expressing efferocytic receptors, particularly in BAT, suggesting that enhanced efferocytosis may contribute to the high remodelling potential and resistance to inflammation observed in BAT. Interestingly, the cold-induced efferocytic response as well as increased Mertk expression were recapitulated in bone marrow-derived macrophages treated with NE or β2-adrenergic agonists in vitro and by injection of NE in vivo. Notably, β2 stimulation failed to induce efferocytosis in Axl/Mertk-deficient BMDMs, indicating that these receptors are essential for NE-induced uptake of dying cells. While immune modulatory effects of β2-adrenergic activation on macrophages have been reported previously, so far we are the first to show direct effects of NE on macrophage efferocytosis. Next, we investigated the contribution of AXL/MERTK-dependent efferocytosis to thermogenic activation in brown and white adipose tissue, by using a mouse model lacking the expression of Axl and Mertk specifically in macrophages (Csf1r-Cre+-Axlf/fMertkf/f mice). These mice showed lower thermogenic gene expression in iBAT and especially ingWAT when fed a high fat diet followed by repeated cold exposure. Moreover, under these conditions, mice lacking macrophage Axl and Mertk expression, exhibited lower signs of lipolytic activity in adipose tissues as shown by decreased levels of phosphorylated (active) hormone sensitive lipase and lower NE stimulated release of non-esterified fatty acids by BAT explants. Impairment in lipolysis was associated with reduced fasting plasma triglyceride and glucose levels, suggesting potential systemic metabolic consequences. Consistent with the known role of efferocytosis in maintaining macrophage anti-inflammatory polarization, the observed reduction in thermogenic gene expression and lipolysis in Csf1r-Cre+-Axlf/fMertkf/f mice were accompanied by increased inflammation in ingWAT. This included elevated levels of macrophage markers in adipose tissue, higher mRNA expression of pro-inflammatory cytokines such as TNFα and IL6, as well as the accumulation of Ly6C⁺ and iNOS⁺ inflammatory macrophages. Of note, TNFα has been shown to suppress adrenergic activation of adipose tissue, suggesting a potential mechanism by which Axl/Mertk deficiency in macrophages might impair adipose thermogenic and lipolytic function. Altogether our findings identify a novel NE–AXL/MERTK axis that enhances macrophage efferocytic activity in response to adrenergic stimuli. Moreover, this effect appears to facilitate effective tissue thermogenic and lipolytic activation in adipose tissue, possibly by preventing excessive inflammation. These insights have important implications for the neuroendocrine regulation of immune function as well as for understanding adipose tissue health and disease.

Zusammenfassung: Während kalter Temperaturen oder während eines Energiedefizits, leitet der menschliche Körper komplexe Anpassungsreaktionen ein, um seine thermische und energetische Homöostase aufrechtzuerhalten. Eine entscheidende Komponente dieser Reaktionen ist die Aktivierung des sympathischen Nervensystems, die zu einer lokalen Freisetzung von Norepinephrin (NE) im Fettgewebe führt. NE wiederum wirkt auf adrenerge Rezeptoren und stimuliert sowohl Thermogenese als auch Lipolyse in Adipozyten. Diese Prozesse sind besonders ausgeprägt im braunen Fettgewebe (BAT), das für seine thermogene Kapazität und seine Reaktionsfähigkeit auf Kältereize bekannt ist, und im subkutanen weißen Fettgewebe (WAT), welches einen thermogenen (beigen) Phänotyp annehmen kann. Die Aktivierung des braunen und beigen Fettgewebes wird aktiv als therapeutische Strategie zur Behandlung von Fettleibigkeit und metabolischem Syndrom erforscht, da sie zur Steigerung des Energieverbrauchs und zur Verbesserung der Insulinempfindlichkeit beitragen kann. Eine anhaltende thermogene Aktivität erfordert dabei einen erheblichen strukturellen Umbau des Fettgewebes. Makrophagen spielen in solchen Umbauprozessen eine zentrale Rolle, indem sie durch Efferozytose - die Aufnahme und Beseitigung sterbender Zellen - einen spezialisierten entzündungshemmenden und gewebeumgestaltenden Makrophagen-Phänotyp annehmen. Dabei hängt Efferozytose entscheidend von Rezeptoren wie AXL und MERTK ab. Besonders Fettgewebsmakrophagen (ATMs) werden zunehmend als entscheidende Regulatoren der metabolischen Gesundheit und der Gewebeanpassung anerkannt. Eine gestörte Efferozytosefunktion in ATMs wird dabei mit Stoffwechselstörungen wie Typ-2-Diabetes in Verbindung gebracht. In dieser Studie nutzten wir Kälteexposition, um eine thermogene Aktivierung sowie einen Gewebeumbau im Fettgewebe zu induzieren. Dabei untersuchten wir die Rolle der Makrophagen-Efferozytose während dieses Prozesses. Wir fanden heraus, dass F4/80⁺CD11b⁺-Makrophagen, die aus der interskapulären BAT (iBAT) und der inguinalen WAT (ingWAT) von kalt gehaltenen C57BL/6-Mäusen isoliert wurden, eine signifikant höhere Efferozytose-Kapazität aufwiesen als die Makrophagen von thermoneutral gehaltenen Kontrollen. Diese erhöhte Efferozytose war mit einem höheren Anteil von ATMs verbunden, die Efferozytose-Rezeptoren wie MERTK an ihrer Oberfläche exprimieren. Die stärksten Auswirkungen der Kälteexposition wurden in iBAT-Makrophagen beobachtet, die auch die höchsten absoluten Werte der Efferozytose aufwiesen. Dies unterstützt die Hypothese, dass das hohe Umbaupotenzial und die Resistenz gegen Entzündungen, die im BAT beobachtet werden, auf eine verstärkte lokale Efferozytose zurückzuführen sein könnten. Interessanterweise konnte die kälteinduzierte Efferozytose-Reaktion sowie die erhöhte Mertk-Expression in Makrophagen aus dem Knochenmark (BMDMs) rekapituliert werden, wenn man diese mit β2-adrenergen Agonisten behandelt. Außerdem erhöhte eine NE-Injektion in Wildtyp-Mäusen, die bei Raumtemperatur gehalten wurden, die Efferozytose in CX3CR1⁺Ly6C- ATMs im iBAT signifikant. Auswirkungen der β2-adrenergen Aktivierung auf die Immunfunktion von Makrophagen wurden bereits in vorigen Studien gezeigt, jedoch ist ein solch direkter Effekt auf die Makrophagen-Efferozytose noch nie zuvor berichtet worden. Bemerkenswert ist dabei, dass die β2-Stimulation in Axl/Mertk-defizienten BMDMs nicht dieselbe Efferozytose Antwort auslöste, was darauf hindeutet, dass diese Rezeptoren für die NE-induzierte Efferozytose wesentlich sind. Als nächstes untersuchten wir den Beitrag der AXL/MERTK-abhängigen Efferozytose zur thermogenen Aktivierung des braunen und weißen Fettgewebes. Dazu wurde ein Mausmodell verwendet, bei dem die Expression von Axl und Mertk speziell in Makrophagen fehlt (Csf1r-Cre+-Axlf/fMertkf/f Mäuse). Diese Mäuse zeigten eine geringere thermogene Genexpression im iBAT und insbesondere im ingWAT, wenn sie mit einer fettreichen Diät gefüttert wurden, gefolgt von wiederholter Kälteexposition. Darüber hinaus wiesen Mäuse, denen die Axl- und Mertk-Expression der Makrophagen fehlte, unter diesen Bedingungen deutlich geringere Anzeichen einer lipolytischen Aktivierung im Fettgewebe in vivo auf, was sich in verminderten Spiegeln der phosphorylierten (aktiven) hormonsensitiven Lipase zeigte. Die beeinträchtigte Lipolyse in Csf1r-Cre+-Axlf/fMertkf/f Mäusen wurde auch durch eine geringere NE induzierte Freisetzung nicht veresterter Fettsäuren aus BAT-Explantaten bestätigt. Die Beeinträchtigung der Lipolyse ging mit einer Verringerung der Triglycerid- und -Glukosespiegel im Blutplasma einher, was auf mögliche systemische metabolische Folgen hindeutet. Im Einklang mit der bekannten Rolle der Efferozytose in der Aufrechterhaltung einer entzündungshemmenden Polarisierung in Makrophagen zeigten Csf1r-Cre+-Axlf/fMertkf/f Mäuse erhöhte Entzündungszeichen im ingWAT. Diese Zeichen bestanden aus erhöhten Werte von Makrophagenmarkern im Fettgewebe, einer höheren Expression von pro-inflammatorischen Zytokinen wie TNFα und IL6 und aus einer Ansammlung von Ly6C⁺ und iNOS⁺ entzündlichen Makrophagen. Entzündungszytokine, insbesondere TNFα, unterdrücken nachweislich die adrenerge Aktivierung des Fettgewebes, was auf einen möglichen Mechanismus hindeutet, durch den ein Axl/Mertk-Mangel in Makrophagen möglicherweise die thermogene und lipolytische Funktion des Fettgewebes beeinträchtigen kann. Insgesamt weisen unsere Ergebnisse auf eine neuartige NE-AXL/MERTK-Achse hin, welche die Efferozytenaktivität von Makrophagen als Reaktion auf adrenerge Reize steigert. Darüber hinaus scheint dieser Effekte die thermogene und lipolytische Aktivierung im Fettgewebe zu unterstützen, möglicherweise durch die Hemmung überschießender Entzündungsreaktionen. Diese Erkenntnisse haben Implikationen für die neuroendokrine Kontrolle von Immunfunktionen und dessen Einfluss auf die Gesundheit und Funktionalität des Fettgewebes.