Mechanism of resistance to cisplatin in ovarian cancer

Abstract

Cisplatin (cis-Pt) oder cis-Diamindichlorplatin II ist eines der wirksamsten Chemotherapeutika zur Behandlung vieler bösartiger Tumorerkrankungen des Menschen. Die entwickelte Resistenz gegen das Medikament ist jedoch ein großes Hindernis für den erfolgreichen Einsatz. Eierstockkrebs, der als eine der schwersten gynäkologischen Krebserkrankungen des weiblichen Fortpflanzungssystems gilt ist eine tödliche bösartige Erkrankung mit einer niedrigen Überlebensrate. Medikamente auf Platinbasis wie cis-Pt bilden das Rückgrat der derzeit verfügbaren Behandlung für Eierstockkrebspatientinnen. Mehr als 70 % der Patientinnen erleiden jedoch einen Rückfall und entwickeln eine Resistenz gegen das Medikament, was zu einer niedrigen Überlebensrate führt. Um dieses Problem zu überwinden und den Nutzen der Behandlung zu maximieren, ist es wichtig den Mechanismus der Resistenz zu entschlüsseln. Ziel dieser Studie war es, die zugrunde liegenden Mechanismen der cis-Pt-Resistenz zu verstehen. Anhand von Eierstockkrebszellen untersuchten wir Veränderungen der RNA durch die Behandlung mit cis-Pt. Wir zeigen dass die Aktivierung von Signalwegen, die zu dem resistenten Phänotyp führen, durch cis-Pt induzierten RNA-Schäden ausgelöst wird.

In dieser Studie haben wir herausgefunden, dass GCN2 (General Control Non-Derepressible2) die cis-Pt-Resistenz in einem Eierstockkrebsmodell, den SKOV3-Zellen, vermittelt. Wir zeigen, dass eine längere Exposition gegenüber cis-Pt zu Ribosomenkollisionen führt und ribotoxischen Stress auslöst, der durch den Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK)-Stoffwechselweg wahrgenommen und kaskadiert wird. Parallel dazu aktivieren diese Kollisionen auch den GCN2-Arm der integrierten Stressreaktion (ISR). GCN2 ist ein Regulator der Stressreaktionswege der Zelle, der Stress entgegenwirkt und das Überleben der Zellen fördert. Unter solchen Bedingungen hilft GCN2 den Zellen, den entstehenden Stress abzumildern. Eine Erschöpfung von GCN2 erweist sich als fatal für die Zellen, wenn sie mit cis-Pt behandelt werden, und sie erliegen der schädlichen Wirkung des Medikaments, was die kritische Rolle von GCN2 unterstreicht. Wir zeigen, dass die Behandlung mit cis-Pt die ZAKα-JNK-Achse des MAPK-Signalweges aktiviert. GCN2 wirkt als schützende Barriere und hilft den Zellen, den cis-Pt-Stress zu überwinden und Resistenz zu erwerben. In Abwesenheit von GCN2 induziert die Kontinuität und Schwere der aktivierten JNK Apoptose in SKOV3-Zellen. Unsere Ergebnisse ergänzen die Belege für die doppelte Rolle von JNK beim Zellüberleben und bei der Apoptose. Wir führen die Aktivierung dieser Signalwege auf die cis-Pt-induzierte Veränderung der tRNA-Modifikation zurück.

RNAs sind mit einer Vielzahl von Modifikationen versehen, und diese Modifikationen beeinflussen fast jeden biologischen Prozess, einschließlich der Resistenz gegen Chemotherapeutika. Im Rahmen dieser Studie haben wir auch die Auswirkungen von cis-Pt auf die Konzentrationen der am weitesten verbreiteten mRNA-Modifikation, nämlich m6A, und ihrer Regulatoren „Writers and erasers“ in den Zelllinien des Eierstockkrebses bestimmt.

Unsere Ergebnisse unterstreichen die Rolle von RNA-Modifikationen und erfordern eine umfassende Analyse von Modifikationen an zellulären RNAs. Als Schritt in diese Richtung arbeiteten wir auch an einem neuen Ansatz zur Sequenzierung von tRNAs unter Verwendung der Nanopore-Plattform. Unter allen RNA-Molekülen sind tRNAs die am stärksten modifizierten, mit durchschnittlich 13 modifizierten Basen pro tRNA. Die heute gebräuchlichen Sequenzierungsmethoden sind jedoch nur begrenzt in der Lage, diese so wichtigen Moleküle zu sequenzieren. Hierbei stellen die Modifikationen die größte Herausforderung dar, da diese das Ergebnis dieser Methoden beeinflusst. Mit dem Ziel, eine umfassendere Methode zur Analyse von tRNAs zu entwickeln, widmete sich diese Studie auch der Entwicklung einer Methode zur Sequenzierung von tRNAs auf der Nanopore-Plattform. Die Technik zeigt Potenzial und wird dazu beitragen, tRNAs mit ihren Modifikationen zu sequenzieren und die Rolle der dynamischen Modifikationen zu entschlüsseln.

Cisplatin (cis-Pt) or cis diamminedichloroplatinum II is one of the most effective chemotherapeutic agents used in the treatment of many human malignances. But resistance to the drug is a major barrier to the successful use of the drug. Ovarian cancer, regarded as one of the most severe gynecological cancers impacting the female reproductive system, is a fatal malignancy with a low survival rate. Platinum-based drugs such as cis-Pt form the backbone of the currently available treatment offered to ovarian cancer patients. However, more than 70% of the patients relapse and develop resistance to the drug, leading to poor survival. In order to overcome this problem and maximize the benefits of the treatment, it is important to decipher the mechanism of resistance. This study aimed at understanding the underlying mechanisms involved in cis-Pt resistance. Using ovarian cancer cells, we investigated alterations to the RNA as an effect of treatment with cis-Pt. We demonstrate the activation of signaling pathways as an effect of cis-Pt induced RNA damage which leads to the resistant phenotype.

In this study, we unravel that general control non-derepressible (GCN2) mediates cis-Pt resistance in an ovarian cancer model, SKOV3 cells. We demonstrate that prolonged exposure to cis-Pt leads to ribosome collision and results in ribotoxic stress which is sensed and cascaded down by the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway. In parallel, these collisions also activate the GCN2 arm of the integrated stress response (ISR). GCN2, is a regulator of the cells’ stress response pathways which acts to resolve stress and aids cell survival. Under such conditions, GCN2 helps the cells mitigate the resulting stress. Depletion of GCN2 proves fatal to the cells when treated with cis-Pt and they succumb to the harmful effect of the drug emphasizing the critical role of GCN2. We show that treatment with cis-Pt activates the ZAKα - JNK axis of the MAPK signaling pathway. GCN2 acts as a protective barrier and helps the cells overcome the cis-Pt stress and acquire resistance. In absence of GCN2, the continuity and severity of the activated JNK induces apoptosis in SKOV3 cells. Our results also add to the evidence supporting the dual role of JNK in cell survival and apoptosis. We attribute activation of these signaling pathways as a result to the cis-Pt induced alteration of tRNA modification.

RNAs are decorated with vast variety of modifications and these modifications affect almost every biological process including resistance to chemotherapeutic agents. As a part of this study, we also determined the effect of cis-Pt on the levels of the most prevalent mRNA modification, namely m6A, and its regulators (the writers and erasers) in the ovarian cancer cell lines.

Our findings emphasize the role of RNA modifications and demands a comprehensive analysis of modifications on cellular RNAs. As a step in this direction, we also worked on a new approach to sequence tRNAs using the nanopore platform. Amongst all RNA molecules, tRNAs rank the highest for their modifications with an average of 13 modified bases in each tRNA. Commonly used sequencing methods today, however, are limited in their capacity to sequence these all so important molecules; modifications being the most important challenge affecting the outcome of these approaches. Aiming to develop more comprehensive way to analyze tRNAs, this study also dedicated efforts towards establishing a method to sequence tRNAs on the nanopore platform. The technique shows potential and will help sequence tRNAs with their modifications and will contribute to deciphering the role of dynamic modifications.