Der Einfluss von Naringenin-5-O-rhamnosid auf Kolitis

Abstract

Chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED) wie Colitis Ulcerosa und Morbus Crohn sind durch eine Störung der intestinalen Barriere, ein verändertes Mikrobiom sowie eine unkontrollierte Immunantwort gekennzeichnet. In der Therapie kommen zurzeit unterschiedliche Medikamente zum Einsatz, die vor allem die Entzündungsreaktion modulieren. Ziel ist dabei die Kontrolle akuter entzündlicher Schübe und die Erhaltung von Remission. In den letzten Jahrzehnten haben sich die therapeutischen Möglichkeiten stetig weiterentwickelt, sodass heutzutage eine Bandbreite an Medikamenten zur Verfügung steht. Neben konventionellen immunregulatorischen Medikamenten wie z.B. Glukokortikoiden, 5-Aminosalicylsäure oder Azathioprin kann eine zielgerichtete Therapie durch Biologika und Small Molecules zum Einsatz kommen. Obwohl in den vergangenen Jahren deutliche Fortschritte in den Behandlungsmöglichkeiten erzielt und damit die Lebensqualität von Patienten mit CED gesteigert werden konnte, weisen alle zurzeit eingesetzten Medikamente Nebenwirkungen und Limitationen auf. Daher ist die Entwicklung neuer Therapieoptionen von großer Relevanz. Ziel dieser Arbeit war es, den Einsatz einer neuen Verbindung, Naringenin-5-O-Rhamnosid (N5R), in der Therapie von CED zu untersuchen. Das Vorläufermolekül des N5Rs, Naringenin, wurde aufgrund seiner vielseitigen biologischen Eigenschaften bereits als potenzieller Kandidat in der Therapie von CED diskutiert. Naringenin ist ein Flavonoid und weist als Polyphenol antientzündliche und antioxidative Effekte auf. Nichtsdestotrotz ist es durch seine hohe Lipophilie schlecht bioverfügbar und sein therapeutischer Einsatz limitiert. Durch die Entwicklung von N5R könnte diese Limitation behoben werden. N5R weist ein zusätzliches Zuckermolekül auf, wodurch die neuartige Verbindung im Vergleich zum Naringenin hydrophiler und damit besser bioverfügbar ist. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, dass N5R durch die Glykosylierung zusätzliche protektive Eigenschaften entfalten kann. In einem ersten Schritt sollte in dieser Arbeit die Wirksamkeit von N5R im Vergleich zu Naringenin untersucht werden. Im zweiten Teil der Arbeit ging es um die Identifikation eines möglichen Wirkungsmechanismus von N5R. Um die Wirksamkeit von N5R zu untersuchen, wurden zunächst in vitro Differenzierungen von CD4+ T-Zellen, die als entscheidende Akteure in der Pathologie von CED beschrieben werden, betrachtet. Hierbei wurde ein Effekt des Vorläufermoleküls Naringenin auf die T-Zellen beobachtet, jedoch nicht von N5R. So förderte Naringenin im Gegensatz zu N5R die Differenzierung der antientzündlichen Treg-Zellen und hemmte die Differenzierung der proinflammatorischen TH1- und TH17-Zellen. Da angenommen wird, dass N5R erst nach Spaltung durch die intestinale Mikrobiota in seine biologisch aktive Form Naringenin umgewandelt wird, erfolgte daraufhin die Testung von N5R in vivo. Hierbei wurde der Einfluss von N5R im murinen Modell der akuten DSS-Kolitis im Vergleich zu Naringenin betrachtet. Es zeigte sich ein protektiver Effekt sowohl von N5R als auch von Naringenin im Vergleich zur Kontrollgruppe. Um den Wirkmechanismus des N5R zu untersuchen, wurde eine Zellanalyse per Durchflusszytometrie an Tag 9 der DSS-Kolitis durchgeführt. In der Analyse der T-Zellen ließ sich eine signifikante Erhöhung der Foxp3+ Treg-Zellen nachweisen. Um den Einfluss des angeborenen Immunsystems bei der Wirkungsweise von N5R genauer zu erforschen, wurde in einem nächsten Schritt das Modell der akuten DSS-Kolitis in lymphopenen Mäusen wiederholt. Hier zeigte sich ohne Beteiligung des adaptiven Immunsystems eine Aufhebung des protektiven Effektes von N5R. Dies führte zu der Annahme, dass das adaptiven Immunsystems eine wichtige Rolle bei der Vermittlung des protektiven Einflusses von N5R spielt. Daher wurde N5R nachfolgend im Modell der T-Zell-Transfer-Kolitis, welche durch die Expansion von proinflammatorischen TH1- und TH17-Zellen gekennzeichnet ist, untersucht. Es zeigte sich im Vergleich zur Kontrollgruppe ein stark protektiver Effekt durch N5R und in geringerem Ausmaß auch durch Naringenin. In einem finalen Schritt wurde die Interaktion von N5R mit Treg-Zellen im Modell der akuten DSS-Kolitis in mit DEREG-Zellen rekonstituierten lymphopenen Mäusen erforscht. In diesem Modell lassen sich die Treg-Zellen spezifisch ausschalten. In der Kontrollgruppe ohne Depletion der Treg-Zellen ließ sich erneut ein protektiver Effekt von N5R nachweisen. Nach Depletion der Treg-Zellen war der protektive Effekt von N5R nicht vorhanden. Diese Ergebnisse deuten an, dass T- Zellen und speziell Treg-Zellen eine entscheidende Rolle im Wirkmechanismus von N5R spielen. Insgesamt zeigt diese Arbeit, dass N5R ein vielversprechender therapeutischer Ansatz in Tiermodellen für CED ist und eine optimierte Alternative zu seinem Vorläufermolekül Naringenin darstellt, da es einfacher anzuwenden und teilweise wirksamer ist. Es besteht die Annahme, dass N5R diesen Effekt zumindest teilweise über eine Induktion von Treg-Zellen und eine Hemmung proinflammatorischer T-Zellen bewirkt. Das Nutrazeutikum N5R könnte in Zukunft in der Therapie von CED neben den etablierten Medikamenten einen wichtigen Therapiepfeiler darstellen.

Chronic inflammatory bowel diseases (IBD), such as ulcerative colitis and Crohn's disease, are characterized by a disruption of the intestinal barrier, an altered microbiome, and an uncontrolled immune response. Various drugs are currently used in therapy, which primarily modulates the inflammatory response. The aim is to control acute inflammatory episodes and to maintain remission. Over the past decades, therapeutic options have steadily evolved, so a wide range of drugs is available today. In addition to conventional immunoregulatory drugs, such as glucocorticoids, 5-aminosalicylic acid, or azathioprine, targeted therapy by biologics and small molecules can be used. Although significant progress in treatment options has been achieved in recent years, thus improving the quality of life of patients with IBD, all currently used drugs have side effects and limitations. Therefore, the development of new therapeutic options is of great relevance. This work aims to investigate the use of a new compound, Naringenin-5-O-Rhamnoside (N5R), in the therapy of IBD. The precursor molecule of N5R, naringenin, has already been discussed as a potential candidate in the therapy of IBD due to its versatile biological properties. Naringenin is a flavonoid and exhibits anti-inflammatory and antioxidant effects as a polyphenol. However, its poor bioavailability, caused by its high lipophilicity, limits naringenins therapeutic use. The development of N5R could overcome this limitation. N5R features an additional sugar molecule, making the novel compound more hydrophilic and thus more bioavailable compared to naringenin. Furthermore, there is a possibility that N5R may display additional protective properties through glycosylation. In the first step, this work will investigate the efficacy of N5R compared to naringenin. The second part of the work will focus on the identification of a possible mechanism of action of N5R. To investigate the efficacy of N5R, in vitro differentiation of CD4+ T cells, which are described as crucial players in the pathology of IBD, was first considered. Here, an effect of the precursor molecule naringenin on T cells was observed, but not of N5R. Thus, in contrast to N5R, naringenin promoted the differentiation of anti-inflammatory Treg cells and inhibited the differentiation of proinflammatory TH1 and TH17 cells. Since it is assumed that N5R is converted to its biologically active form, naringenin, only after cleavage by the intestinal microbiome, N5R was then tested in vivo. Here, the influence of N5R in the murine model of acute DSS-colitis was assessed in comparison to naringenin. It showed a protective effect of N5R and naringenin compared to the control group. To investigate the mechanism of action of N5R, cell analysis by flow cytometry was performed on day nine of DSS-colitis. A significant increase in Foxp3+ Treg cells could be detected in the analysis of T cells. To further explore the influence of the innate immune system in the mode of action of N5R, the next step was to repeat the model of acute DSS-colitis in lymphopenic mice. Here, the protective effect of N5R was shown to be abrogated without the involvement of the adaptive immune system. This led to the assumption that the presence of the adaptive immune system is essential for N5R to exert its protective effects. Therefore, subsequently, N5R was investigated in the model of T cell transfer colitis, which is characterized by the expansion of proinflammatory TH1 and TH17 cells. A strong protective effect by N5R and to a lesser extent by naringenin was shown compared with the control group. In a final step, the role of Foxp3+ Treg cells in mediating the protective effects of N5R was explored in the model of acute DSS-colitis. To this end lymphopenic mice were reconstituted with DEREG cells. In this model, Treg cells can be specifically deleted. In the control group, without deletion of Treg cells, a protective effect of N5R could again be demonstrated. After the deletion of Treg cells, the protective effect of N5R was not present. Taken together, the results suggest T cells, and specifically Treg cells play a crucial role mediating the effect of N5R. Overall, this work shows that N5R is a promising therapeutic approach in animal models for IBD and represents an optimized alternative to its precursor molecule, naringenin, due to its easier application and partially increased efficacy. Furthermore, our data suggest that the protective effect of N5R is mediated at least in part via expansion of Treg cells and inhibition of proinflammatory T cells. In the future, the nutraceutical N5R could represent an important therapeutic pillar in the therapy of IBD, in addition to the established drugs. However, further translational work is required to establish its use in clinic.