Analyse der Transformationseffizienz sowie CRISPR-Cas9 basierter Mutationen in Lactococcus spp.

Abstract

Durch Fermentation von High-Protein Milchprodukten mit Lactococcus spp. können Peptide entstehen, die zu einem bitteren Fehlgeschmack führen. Es ist unklar, inwieweit die Enzyme des proteolytischen Systems dafür verantwortlich sind. Bei Fermentation mit PrtP-positiven Stämmen entstehen Bitterpeptide, wobei dies bei PrtP-negativen Stämmen nicht beobachtet werden konnte. Starterkulturstämme, die zur Fermentation eingesetzt werden, enthalten eine Vielzahl endogener Plasmide. Die Gene der Proteine des proteolytischen Systems sind auf diesen Plasmiden und chromosomal kodiert. Die Untersuchung von Mutanten im Vergleich zu ihren Wildtypen ist von besonderem Interesse, um herauszufinden, welche Gene, die für Proteine des proteolytischen Systems kodieren, zur Entstehung von Bitterpeptiden beitragen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein System entworfen, welches sich zur Punktmutation der chromosomal kodierenden Gene des proteolytischen Systems in Nisin induzierbaren Stämmen anwenden lässt. Das Zwei-Plasmid System beruht dabei auf einer Rekombinase, die über eine Reparaturvorlage (auch Reparatur-Template genannt) die gewünschte Mutation einbaut, und einem CRISPR-Cas9 Plasmid, das durch Mutation der PAM-Sequenz als Gegenselektionsmittel genutzt werden kann. Durch dieses System konnten erfolgreich Mutationen von codY, eines Transkriptionsregulators, und der CodY Bindestelle vor dem oppD-Gen, einem Transporter des proteolytischen System, eingebaut werden. Eine Veränderung der Wachstumsrate der Mutanten im Vergleich zum Wildtyp in Milchcitrat Boullion konnte nicht festgestellt werden. Des Weiteren wurde ein Einzel-Plasmid System mit einem Xylose Promotor entworfen, um unabhängig von einer Nisin induzierten Expression zu sein. Mit diesem System sollte an der Aminosäure Serin der katalytischen Triade des PrtP der beiden Starterkulturstämme L. cremoris LTH 7122 und L. lactis LTH 7123 eine Punktmutation eingebaut werden, sodass an dieser Position die Aminosäure Alanin, Glycin oder ein Stopcodon vorliegen. Durch Screening über MAMA-PCR sollte eine mögliche Mutation erkannt werden und somit der Screeningaufwand durch Sequenzierung möglichst gering gehalten werden. Es konnte keine Mutation durch das Xylose-System erzeugt werden, da durch Testung verschiedener Parameter der Transformation und MAMA-PCR ausgeschlossen werden konnte, dass aufgrund dessen die Mutation in den Starterkulturstämmen nicht erfolgreich war. Durch SDS PAGE Gelelektrophorese konnte gezeigt werden, dass bei Xylose-Induzierung keine Überexpression der Rekombinase erfolgt. Somit ist vermutlich eine Induzierung mittels Xylose in milchassoziierten Lactococcus spp. Stämmen nicht möglich. Die Transformierbarkeit der beiden Starterkulturstämme wurde untersucht, indem versucht wurde, den pTRCas9 Vektor, welcher eine CRISPR-Cas9 Kassette trägt, und dessen Derivate über Elektroporation oder Konjugation in die Stämme einzubringen. Es ist festzustellen, dass eine Transformation des CRISPR-Cas9 Vektors unter den in dieser Arbeit angewendeten Methoden nicht möglich ist. Dies liegt vermutlich weder an dem Replikationsursprung, an der verwendeten Menge Plasmid, noch an den getesteten optischen Dichten. Stammspezifische Eigenschaften sind wahrscheinlich ausschlaggebend für die Transformationseffizienz bestimmter Plasmide. Die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse zeigen, dass Transformationseffizienzen der Starterkulturstämme der Spezies Lactococcus spp. nicht der Transformationseffizienz des bekannten Stammes L. cremoris NZ9000 entsprechen. Von den verwendeten Replikons konnten nur zwei mit großer Transformationseffizienz in die Starterkulturstämme eingebracht werden. Es müssen weitere Untersuchungen erfolgen, um festzustellen, ob dies aufgrund der Größe des Plasmids nicht möglich war, oder aufgrund des CRISPR-Cas9 induzierten Doppelstrangbruchs. Es gilt weitere Forschung mit der Fragestellung anzustoßen, wieso Starterkulturstämme, die endogene Plasmide tragen, manche Vektoren eher aufnehmen als andere. Ein möglicher Einflussfaktor sind die Inkompatibilitätsgruppen der Plasmidklassen, da diese die stabile Koexistenz exogener und endogener Plasmide limitieren können. Weitere Untersuchungen abseits der klassischen Überprüfungen (Rückgrat, Plasmidmenge, optische Dichte) sind notwendig. Bei erfolgreicher Transformation lassen sich mit dem entwickelten CRISPR-Cas9 System Mutationsraten von 75 % bei chromosomal kodierten Genen erzeugen. Zur Mutation von plasmidkodierten Genen, wie dem prtP, mittels des in dieser Arbeit entwickelten Systems, ist weitere Forschung nötig.