Controlled beams of cryo-cooled proteins

Abstract

Single-particle diffractive imaging (SPI) enabled by x-ray free-electron lasers is a promising approach for obtaining native-structure information of proteins with atomic spatial resolution and femtosecond temporal resolution. In this diffractbefore-destruct approach, fresh proteins in native-like states have to be continuously replenished at the xray focus, ideally with one diffraction pattern generated per pulse. However, protein sample delivery, among other challenges, remains a major bottleneck in SPI, primarily because proteins are strongly susceptible to Brownian motion and their native structures are fragile in the gas phase. In this thesis, an improved particledelivery setup tailored to protein-like particles, a cryogenic buffer-gas-cellaerodynamic-lens-stack (BGC-ALS), was demonstrated. A new characterization workflow was established that allows protein-like particle beams generated by the BGCALS to be reliably detected using strong-field ionization (SFI), whereas such detection was nearly infeasible with conventional optical-scattering approaches. Using this workflow, shock-frozen protein-like particle beams were observed to be narrower and denser than the roomtemperature beams. Together with simulations, this was attributed to the tighter aerodynamic-focusing as a result of Brownian-motionsuppression upon cooling. In addition, dense beams of real protein complexes were produced under the optimized BGC-ALS conditions. In particular, indications of the proteinsolvent interactions under SFI were observed, providing evidence that the beams were potentially hydrated and suggesting that the proteins are more likely to retain native-like structures. Collectively, these finely controlled, shock-frozen, focused, and hydrated protein and protein-like particle beams generated by the BGC-ALS are well-suited for future SPI experiments, paving the way toward high-resolution measurements of native protein structures and their dynamics.

Die durch Röntgen-Freie-Elektronen-Laser ermöglichte diffraktive Einzelpartikel-Bildgebung (single-particle diffractive imaging, SPI) stellt einen vielversprechenden Ansatz dar, um Strukturinformationen von Proteinen in ihrem nativen Zustand mit prinzipiell atomarer räumlicher Auflösung und Femtosekunden-Zeitauflösung zu gewinnen. Bei diesem diffract-before-destruct-Ansatz müssen frische Proteine in nativähnlichen Zuständen kontinuierlich am Röntgenfokus nachgeliefert werden, idealerweise so, dass pro Puls ein Beugungsmuster erzeugt wird. Die Probenzuführung von Proteinen bleibt jedoch neben weiteren Herausforderungen ein wesentlicher Engpass in der SPI, vor allem da Proteine stark der Brownschen Bewegung unterliegen und ihre nativen Strukturen in der Gasphase fragil sind. In dieser Dissertation wurde ein verbesserter, auf Proteine zugeschnittener Partikelzuführungsaufbau demonstriert: ein kryogener Buffer-Gas-Cell-Aerodynamic-Lens-Stack (BGC-ALS). Es wurde ein neuer Charakterisierungsworkflow etabliert, der es ermöglicht, durch den BGC-ALS erzeugte proteinähnliche Partikelstrahlen mittels Starkfeldionisation (strong-field ionization, SFI) und Velocity-Map-Imaging zuverlässig nachzuweisen; dies war mit herkömmlichen auf optischer Streuung basierenden Ansätzen nahezu nicht realisierbar. Mithilfe dieses Workflows wurde beobachtet, dass schockgefrorene proteinähnliche Partikelstrahlen schmaler und dichter sind als Strahlen bei Raumtemperatur. Zusammen mit Simulationen wurde dies auf eine stärkere aerodynamische Fokussierung infolge der Unterdrückung der Brownschen Bewegung durch Kühlung zurückgeführt. Darüber hinaus wurden unter optimierten BGC-ALS-Bedingungen dichte Strahlen realer Proteinkomplexe erzeugt. Insbesondere wurden unter SFI Hinweise auf Protein-Lösungsmittel-Wechselwirkungen beobachtet, was Evidenz dafür liefert, dass die Strahlen potenziell hydratisiert waren, und darauf hindeutet, dass die Proteine mit höherer Wahrscheinlichkeit in einer der nativen Struktur ähnlichen Form vorlagen. Insgesamt eignen sich diese durch den BGC-ALS erzeugten, präzise kontrollierten, schockgefrorenen, fokussierten und hydratisierten Protein- und proteinähnlichen Partikelstrahlen gut für zukünftige SPI-Experimente und ebnen den Weg zu hochauflösenden Messungen nativer Proteinstrukturen und ihrer Dynamik.