Analysis of sequestration mechanisms in the large milkweed bug, Oncopeltus fasciatus (DALLAS, 1852)

Abstract

The coevolution of plants and herbivorous insects over several hundred million years has driven an astonishing diversity of plant defense strategies and counterstrategies of their herbivores. Herbivore adaptations to toxic cardenolide-producing plants involve tolerance mechanisms like target-site (Na,K-ATPase) insensitivity or permeability barriers as well as resistance mechanisms like biotransformation, excretion and sequestration. Sequestration into compartments is a widespread strategy in insects to cope with the chemical defenses of their host plants and is the crucial adaptation that escalates the evolutionary arms race to the third trophic level. While sequestration has evolved convergently in members of all six insect orders that have specialized on cardiac glycoside-producing plants, little is known about the underlying molecular mechanisms. Oncopeltus fasciatus (DALLAS, 1852) is among the best-characterized species with regard to its adaptation to cardenolides, especially in terms of target-site insensitivity, biotransformation, and sequestration physiology. However, even in this species the molecular key components and mechanisms for sequestration are unknown. Yet, characterization of molecular components of the sequestration system is crucial for understanding its evolution, and the list of plant defense compound transporters in specialized insects is still extremely short. In this dissertation, I characterize the presence and function of ATP-binding cassette (ABC) subfamily B full transporters in cardenolide sequestration in O. fasciatus, which have long been considered prime candidates for cardenolide transport. Recently, it was shown that insect ABCB full transporters are activated by and transport cardenolides in vitro. Transcriptome, gene expression, and immunohistochemical analyses were combined with RNA interference in this thesis to define the role of ABCB full transporters in cardenolide sequestration, which had remained unaddressed to date. In a first step towards this characterization, ten reference genes, which were lacking for the milkweed-bug-system at that time, were identified. Ofef1a and Oftubulin were evaluated as the most suitable normalizers upon temporal cardenolide challenge by comprehensive stability algorithm analysis (Bestkeeper, Normfinder, geNorm, comparative ΔCt method). While there are no universal stable reference genes, revalidation across multiple treatments, like diet or tissues, shows that the Ofef1a gene comes very close to this state. Along these lines, a robust approach to RT-qPCR primer design for organisms with unannotated genomes is shown. In addition, insights into stability evaluation in multifactorial experimental designs are given, as time-scaled analyses can be particularly important in ABC transporter research. My combined in vivo and in vitro analyses provide the first evidence that ABCB full transporters are tightly associated with cardenolide sequestration in O. fasciatus. Of the two OfABCB full transporters identified in O. fasciatus, OfABCB1 was indispensable for ouabain sequestration capacity, unlike OfABCB2. The knockdown of Ofabcb1 by RNA interference resulted in a significant drop in sequestration capacity by up to 70 % in vivo. Its enrichment in tissues important for tolerance to and resistance against cardenolides suggests a pleiotropic role: on the one hand as the evolutionarily conserved chemoprotective barrier, and on the other hand through the acquisition of a new function in sequestration. The enigmatic role of its homolog, OfABCB2, in the cardenolide transport network is an open question to be addressed. Yet, my data suggest that this gene is under complex transcriptional control, potentially diversifying its functions and enabling adaptive flexibility. Subsequent investigations on ouabain sequestration capacity and dynamics in milkweed bug lines long-term acclimatized to different diets (cardenolide-free and -containing) suggest robustness, but also plasticity of cardenolide storage in O. fasciatus, which is to a certain degree detached from defensive fluid accumulation. Chemical and pilot immunohistological analyses suggest that this plasticity in sequestration is related to nutritional and molecular mechanisms involving ABCB full transporter proteins. Yet, the two OfABCB transporters as well as dietary cardenolides were not mandatory for defensive fluid accumulation, the underlying mechanism of which remains poorly understood. My investigations show that factors like biomass, sex, female age and to some degree also stored cardenolide amount are associated with released defensive fluid volumes and hence likely with defensive efficacy of O. fasciatus. The extensive absence of cardenolide target-sites (Na,K-ATPase) in defensive fluid cells indicated by immunohistochemistry suggests further a safe toxin storage by removal from the metabolism. This likely releases O. fasciatus from toxicity constraints in sequestration known for certain cardenolides. These findings along with the overexpression of one of its insensitive Na,K-ATPase paralogs (α1A) on the total mRNA level upon ouabain accumulation suggest a close interrelation between sequestration and Na,K-ATPase insensitivity in O. fasciatus.

Die Koevolution zwischen Pflanzen und herbivoren Insekten über Millionen von Jahren führte zu einer erstaunlichen Vielfalt an Abwehrstrategien bei Pflanzen und entsprechenden Gegenanpassungen von Herbivoren. Anpassungen an giftige cardenolidhaltige Pflanzen beinhalten sowohl Toleranzmechanismen, wie die Wirkort-Unempfindlichkeit (der Na,K-ATPase) gegenüber dem Toxin oder Permeabilitätsbarrieren, als auch Resistenzmechanismen, wie Biotransformation, Exkretion und Sequestration. Die Sequestration in Körperkompartimente ist eine weitverbreitete Strategie bei Insekten, um die chemische Wirtspflanzenabwehr zu überwinden und stellt die kritische Anpassung dar, die das evolutionäre Wettrüsten auf die dritte trophische Ebene eskalieren lässt. Trotz der konvergenten Evolution von Sequestration in Mitgliedern aller sechs Insektenordnungen, die sich auf herzglykosidhaltige Pflanzen spezialisiert haben, sind die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen noch unzureichend verstanden. Oncopeltus fasciatus (DALLAS, 1852) gehört zu den am besten charakterisierten Arten in Hinblick auf seine Anpassungen an Cardenolide, besonders bezüglich der Wirkort-Unempfindlichkeit, der Biotransformation und der Speicherungsphysiologie. Jedoch selbst in dieser Art sind die molekularen Schlüsselkomponenten der Sequestration bislang unbekannt. Gleichzeitig ist die Charakterisierung solcher Sequestrations-System-Komponenten essentiell für das Verständnis ihrer Entstehung und die Liste an Pflanzenabwehrstoff-transportierenden Proteinen in spezialisierten Insekten ist insgesamt immer noch überaus kurz. In dieser Dissertation charakterisiere ich das Vorhandensein von „ATP-binding cassette“ (ABC) Volltransportern der Unterfamilie B, welche schon länger als Spitzenkandidaten für den Cardenolid-Transport angesehen werden, und deren Funktion in der Cardenolidspeicherung bei O. fasciatus. Kürzlich wurde in vitro gezeigt, dass ABCB-Volltransporter von Insekten durch Cardenolide aktiviert werden und diese transportieren. Um die noch ausstehende Rolle von ABCB-Volltransportern im Cardenolid-Sequestrationsprozess zu bestimmen, wurden in dieser Thesis Transkriptom-, Genexpression- und immunhistochemische Untersuchungen mit RNA-Interferenz kombiniert. Als einen ersten Schritt hin zu dieser Charakterisierung wurden zehn Referenzgene identifiziert, die bis zu diesem Zeitpunkt für das Milchkrautwanzen-System fehlten. Ofef1a und Oftubulin wurden als die am besten geeigneten Referenzgene zur Normalisierung der Expression bei unterschiedlicher Cardenolid-Expositions-Dauer mittels umfassenden Stabilitäts-Algorithmen-Analysen bestimmt (Bestkeeper, Normfinder, geNorm, komparative ΔCt Methode). Während es keine universell gültigen Referenzgene gibt, kommt das Ofef1a-Gen dem schon sehr nahe, wie die Revalidierung über weitere verschiedene Zustände, einschließlich Nahrung und Gewebe, zeigt. In diesem Zusammenhang wird auch ein robuster Ansatz für das RT-qPCR-Primer-Design in Organismen mit noch nicht annotierten Genomen gezeigt. Ein zusätzlicher Fokus richtet sich auf die Stabilitätsevaluation in multifaktoriellen Versuchen, da zeitlich skalierte Untersuchungen bei der Forschung zu ABC-Transportern von besonderer Bedeutung sein können. Meine Kombination aus in vivo und in vitro Untersuchungen liefert erste Beweise, dass ABCB-Volltransporter eng mit der Cardenolid-Sequestration in O. fasciatus in Verbindung stehen. Von den beiden identifizierten OfABCB-Transportern war OfABCB1 für die Speicherkapazität von Ouabain unersetzlich im Gegensatz zu OfABCB2. Die Herunterregulation der Ofabcb1-Expression mittels RNA-Interferenz bedingte Abfälle in der Speicherkapazität bis zu 70 % in vivo. Seine Dominanz in Geweben, die wichtig für die Toleranz für und die Resistenz gegen Cardenolide sind, deutet auf eine pleiotrope Rolle dieses Gens hin: Zum einen als evolutionär konservierte biochemische Schutzbarriere und zum anderen mit neuer Funktion in der Sequestration. Die rätselhafte Rolle des homologen Gens, OfABCB2, im Cardenolid-Transport-Netzwerk ist eine offene Frage, die noch geklärt werden muss. Gleichzeitig deuten meine Daten darauf hin, dass dieses Gen unter einer komplexen transkriptionellen Kontrolle steht, was möglicherweise Funktionen diversifiziert und adaptive Flexibilität ermöglicht. Nachfolgende Untersuchungen zu Ouabain-Speicherkapazität und -dynamiken in zwei an unterschiedliche Nahrung langzeitakklimatisierten Milchkrautwanzen-Laborlinien (cardenolid-frei und -beinhaltend) legen die Robustheit des Sequestrationsprozesses nahe, aber gleichzeitig auch dessen Plastizität, was bis zu einem gewissen Grad von der Akkumulation des Abwehrsekretes losgelöst ist. Chemische Analysen und ein immunhistochemischer Pilotversuch deuten darauf hin, dass die Sequestrationsplastizität in Zusammenhang mit nahrungsbedingten und molekularen Mechanismen unter Beteiligung von ABCB-Volltransportern steht. Beide OfABCB-Transporter, wie auch Cardenolide aus der Nahrung, waren aber nicht für die Ansammlung von Abwehrflüssigkeit zwingend erforderlich, deren zugrundeliegender Mechanismus nach wie vor unzureichend verstanden ist. Meine Untersuchungen zeigen, dass mehrere Faktoren, wie Biomasse, Geschlecht, das Alter von Weibchen und bis zu einem gewissen Grad auch die gespeicherte Cardenolidmenge in Verbindung mit dem freigesetzten Abwehrsekretvolumen stehen. Damit stehen sie wahrscheinlich auch mit der Wirksamkeit der Abwehr von O. fasciatus in Zusammenhang. Die weitgehend immunhistochemische Abwesenheit des Cardenolid-Wirkortes (der Na,K-ATPase) in den Zellen des Abwehrsekrets deutet des Weiteren auf eine kompartimentierte und somit sichere Toxin-Speicherung durch den Entzug aus dem Metabolismus hin. Das vermeidet in O. fasciatus wahrscheinlich bestimmte Toxizitätsbeschränkungen in der Sequestration wie es für bestimmte Cardenolide bekannt ist. Zusammen mit der Überexpression des unempfindlichen Na,K-ATPase-Paralogs, α1A, auf Gesamt-mRNA-Niveau bei Ouabain-Akkumulation, deuten diese Erkenntnisse auf eine enge Verbindung zwischen Sequestration und Na,K-ATPase-Unempfindlichkeit in O. fasciatus hin.