Iterative Indirect Immunofluorescence Imaging for Tissue

Abstract

Mit Iterative Indirect Immunofluorescence Imaging (4iT) bzw. PathoPlex konnte ein Verfahren entwickelt werden, welches ein flexibles, skalierbares und reproduzierbares Multiplexing mit anschließender Computeranalyse zur Erstellung molekularpathologischer Atlanten erlaubt. Es wurde für (archiviertes) Formalin-fixiertes Paraffin-eingebettetes Gewebe, wie es für gewöhnlich bei der histopathologischen Diagnostik zur Anwendung kommt, mit Detektion von >60 Proteinen in >25 Zyklen (indirekte Immunfluoreszenz) entworfen. Durch Lichtmikroskopie und Computeranalysen können mit allgemein verfügbaren Antikörpern über 100 Millionen Pixel sowohl in experimentell induzierten Erkrankungen, als auch in menschlichem Gewebe (z.B. Biopsien von Patienten mit Nephropathien) gewonnen werden. Der Einsatz von Lichtmikroskopie und eines 3D-Druckers zur Herstellung von Mikroskopierkammern, welche eine parallele Verarbeitung von über 40 Gewebeproben gleichzeitig ermöglichen, erspart etwa 70% der manuellen Arbeit. Diese Innovationen maximieren die Effizienz, erhöhen die Datenqualität und minimieren Batch-Effekte. Zusätzlich erfolgte die Implementierung eines leistungsstarken Softwarepakets, das GPU- basierte Algorithmen verwendet. Es erweitert das Spektrum der Analysen und die Interpretierbarkeit der Daten. Mit 4iT bzw. PathoPlex können in experimentellen Nierenerkrankungen und in menschlichem Gewebe (z.B. diabetische Nephropathie) biologische Prozesse analysiert und Krankheitsmerkmale identifiziert werden. Die Methode könnte durch Erstellung molekularpathologischer Atlanten mit subzellulärer Auflösung bei der Arzneimittelentwicklung unterstützen und eine Integration in routinemäßige klinische Arbeitsabläufe erfahren.

With Iterative Indirect Immunofluorescence Imaging (4iT) or Pathology-oriented multiplexing (PathoPlex), a process was developed in this work that allows flexible, scalable and reproducible multiplexing with subsequent computer analysis. It is designed for (archived) formalin-fixed paraffin-embedded tissue with detection of >60 proteins in >25 cycles (indirect immunofluorescence, 4iT). Using light microscopy and computer analysis, >100 million pixels can be obtained with commonly available antibodies in experimental and clinical samples. The use of flexible light microscopy, as well as a 3D printer to customize microscopy chambers, allowing parallel processing of over 40 (routine) pathology samples at the same time, saving over 70% hands-on time. These innovations maximize efficiency, increase data quality and minimize batch effects. In addition, a powerful software package was implemented that uses GPU-based algorithms. It expands the spectrum of analyzes and the interpretability of the data. 4iT or PathoPlex has been used both in experimental kidney diseases and in human tissue (diabetic nephropathy) to analyze the biological processes and identify disease characteristics. This method could support drug development by displaying molecular pathology atlases at subcellular resolution and has potential to be integrated into routine clinical workflows.