Zytokeratin-20-Reverse-Transkriptase-Polymerasekettenreaktion zum Nachweis disseminierter Tumorzellen beim Mammakarzinom : Ziele und Grenzen

Abstract

Erstes Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines geeigneten Verfahrens zum Nachweis disseminierter Tumorzellen im Blut und Knochenmark von Mammakarzinom-Patientinnen. Ein solches Verfahren ist von großer klinischer Relevanz, da es bei der Therapie des Mammakarzinoms mit Hochdosis-Chemotherapie und anschließener autologer Progenitorzelltransplantation zur Reinfusion kontaminierender Tumorzellen und damit möglicherweise zur Rezidivbildung kommen kann. Das Standardverfahren zum Nachweis solcher disseminierten Tumorzellen stellte bislang die Immunzytologie dar. Seit einiger Zeit wird zunehmend auch die Polymerasekettenreaktion eingesetzt, da man sich von dieser Methode eine hohe Sensitivität und Spezifität versprach. Die Spezifität der PCR wird in der Literatur kontrovers diskutiert, eine sog. illegitime Gentranskription wurde von verschiedenen Autoren beschrieben. Die Zytokeratin 20-mRNA-Sequenz hatte sich in vielen Untersuchungen bereits als sehr spezifischer Marker für epitheliale Tumoren des Gastrointestinaltrakts dargestellt. Aufgrund der vielversprechenen Ergebnisse für den Nachweis von Tumorzellen gastrointestinalen Ursprungs wurde in der vorliegenen Arbeit zunächst untersucht, ob sich die hohe Spezifität der CK-20-RT-PCR auch für den Nachweis disseminierter Mammakarzinomzellen bestätigt. Daher sollte zunächst eine CK 20-RT-PCR-Methode etabliert werden, die reproduzierbar Ergebnisse mit möglichst hoher Spezifität und Sensitivität erbringt. Die Kalibrierung der CK20-RT-PCR erfolgte an Verdünnungsreihen der Zelllinien HT29, MDA-MB-453 und MCF-7. Die höchste Sensitivität der CK20-RT-PCR wurde mit 1:107 für die Kolonkarzinomzelllinie HT29 erreicht, für die Mammakarzinomzellinien wurden jedoch lediglich maximale Sensitivitäten von 1:105 erreicht. Anschließend wurden mit dieser Methode insgesamt 88 Blut-, Knochenmark- und Leukaphereseproben von Hochriskopatientinnen mit Mammakarzinom untersucht. Insgesamt wurde die CK20-Sequenz in lediglich 9% klinischen Proben amplifiziert. Daher muss von einer zu geringen Transkription der CK20-mRNA in Mammakarzinomzellen ausgegangen werden. Um die Spezifität der CK20-RT-PCR hinsichtlich des selektiven Nachweises epithelialer Zellen zu überprüfen, wurden die hämatologischen Proben eines Kontrollkollektivs bestehend aus 56 Personen ohne epitheliale Tumorerkrankung untersucht. Es zeigte sich mit 14% ein unerwartet hoher Anteil positiver PCR-Ergebnisse in der Kontrollgruppe. Daher stellt sich die Frage, wodurch es zu einem so hohen Anteil an illegitimer Gentranskription kommt. Bekannte Ursachen hierfür sind zum einen biologische Faktoren, wie die Transkription von Pseudogenen, die Induktion der Transkription von Markergenen in nicht-epithelialen Zellen unter bestimmten Bedingungen, wie z.B. die bereits beschriebene low-level-background-Transkription des CK20-Gens in Granulozyten. Zum anderen werden die Ergebnisse auch durch methodisch-analytische Faktoren beeinflusst, wie verschiedene Methoden der Probenbearbeitung oder Auswahl von verschiedenen Kontrollkollektiven. Auch ein Einfluss bestimmter Entzündungsmediatoren auf die Spezifität der RT-PCR wird diskutiert, da in Kontrollkollektiven von Patienten mit chronisch-entzündlichen Erkrankungen ein besonders hoher Anteil falsch-positiver PCR-Ergebnisse nachgewiesen werden konnte. Zweite Zielsetzung dieser Arbeit war es daher, den Einfluss verschiedener Zytokine auf die Spezifität der CK20-RT-PCR zu untersuchen. Für diesen Zweck wurden unterschiedliche Zelllinien maligner Tumoren sowie klinische Knochenmark- und Leukaphereseproben von gesunden Spendern und Patienten mit hämatologischen Tumorerkrankungen untersucht. Je 2x107 Zellen dieser Proben wurde sowohl vor als auch nach Stimulation mit 9 verschiedenen Zytokinen und siebentägiger Kultivierung hinsichtlich einer CK20-Transkription untersucht. Es zeigte sich, dass die Stimulation der Zelllinien und klinischen Proben mit Zytokinen keinen erkennbaren Einfluss auf die CK20-Transkription hatte. Allein in der myeloiden Zelllinie K562, die einer CML in der Blastenkrise entstammt, fand sich in knapp 1/3 der Proben eine CK20-Transkription. Diese trat jedoch unabhängig von Zytokin-Stimulation und Zellkultivierung auf. Über die Ursache der aberranten CK20-Transkription kann zum jetzigen Zeitpunkt nur spekuliert werden. Möglicherweise findet sich auch in dieser myeloiden Zelllinie eine low-level-background-Transkription des CK20-Gens, wie sie bereits für in Granulozyten beobachtet wurde. Zusammenfassend ist festzuhalten, dass die CK20-RT-PCR als Routinemethode zum Nachweis disseminierter Mammakarzinomzellen aufgrund der zu geringen Transkription der CK20-Sequenz in Mammakarzinomzellen und der Beeinträchtigung der Spezifität durch illegitime CK20-Transkription leider nicht ideal ist. Ein Einfluss von Zytokinen auf die CK20-Transkription als Ursache für die wechselnde Spezifität der CK20-RT-PCR konnte in dieser Arbeit nicht nachgewiesen werden.