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dc.contributor.advisorBredehorst, Reinhard (Prof. Dr.)
dc.contributor.authorMünster, Jan
dc.date.accessioned2020-10-19T12:17:18Z-
dc.date.available2020-10-19T12:17:18Z-
dc.date.issued2005
dc.identifier.urihttps://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/1298-
dc.description.abstractZusammenfassung Im Rahmen dieser Arbeit sollten Studien zur rekombinanten Expression der humanen Fucosyltransferase V durchgeführt werden. Die Fucosyltransferase V katalysiert den Transfer von L-Fucopyranose von GDP-Fucose zum Akzeptor- Substrat N-Acetyllactosamin und ist somit an der Bildung von Lex Trisacchariden beteiligt. Da es sich bei dem Protein um ein Typ II Transmembranprotein handelt, wurde der Zytoplasmatische und der transmembrane Bereich sowie ein Teil der Stemregion deletiert. In E. coli wurde die Fucosyltransferase V als „His-Tag“-Fusionsprotein exprimiert und aus dem Zellysat isoliert. Die Expression in Prokaryoten führte zur Bildung unlöslicher Proteinaggregate, die sich nur in sehr geringem Maße in vitro rückfalten ließen. Die N-terminale Fusion mit dem E. coli-MB-Protein führte zur Bildung von löslichem Protein. Alle in E. coli dargestellten Fucosyltransferase-Konstrukte zeigten keine enzymatische Aktivität. In eukaryotischen Zellen konnte die Fucosyltransferase V fusioniert mit der Signalsequenz des Trace-Proteins sekretorisch exprimiert werden. Die mammalen Zellinien CHO und HEK 293 ergaben Ausbeuten von 0,2–1mg/l. Die Insektenzellinie BTI-TN-5B1-4 aus Trichoplusia ni lieferten unter Verwendung des Baculovirus Expressionssystems 1–2mg rekombinante Fucosyltransferase V. Die Verwendung stabil transfizierter Trichoplusia ni-Zellen führte sogar zu Ausbeuten von 10–12 mg/l. Fucosyltransferase V, die in eukaryotischen Zellinien hergestellt wurde, erwies sich als enzymatisch aktiv und lag zu einem großen Anteil als Dimer vor. Die dimere Form wurde durch Ausbildung von intermolekularen Disulfidbrücken gebildet und ließ sich unter Erhalt der enzymatischen Aktivität mit einer Konzentration von 1mM DTT in eine monomere Form reduzieren. Mutationsstudien an zwei unterschiedlichen Cystein-Resten konnten zeigen, daß das Cys64 verantwortlich für die Bildung der Dimere ist. Das an der GDP-Fucose-Bindung beteiligte Cys156 konnte ohne Verlust der enzymatischen Aktivität gegen Serin ausgetauscht werden. Die in eukaryotischen Zellen exprimierte Fucosyltransferase V ist glycosyliert und weist ein hohes Maß an Heterogenität auf. Deglycosylierung mit NGlycosidaseF führte zu einer Verringerung des apparenten Molekulargewichtes und zu einer Fokussierung der Banden im SDS-PAGE. Analysen mit spezifisch bindenden Lektinen zeigten bei der in Insektenzellen exprimierten Fucosyltransferase V eine dominierende Präsenz von „high-Mannose“ N-Glycanen. Zur Entwicklung spezifischer Inhibitoren gegen die Fucosyltransferase V wurden auf Phagen präsentierte Heptapeptid-Bibliotheken gegen das rekombinante Protein selektiert. Die Verwendung einer Bibliothek cirkularisierter Peptide führte zur Selektion eines spezifischen Liganden der rekombinanten Fucosyltransferase V, welcher keine inhibitorische Wirkung auf das Enzym aufwies.de
dc.description.abstractSummary The aim of this study was to establish different methods for recombinant expression of the human fucosyltransferase V in eukaryotic and prokaryotic cell lines. The fucosyltransferase V catalyses the transfer of fucose from the nucleotide donor sugar GDP-fucose to the acceptor-substrate N-acetyllactoseamine and takes part in the biosynthesis of Lex and sLex structures. The enzyme is a type II transmembrane protein. To produce a soluble form of the protein, a truncated form lacking the cytoplasmic-, the transmembraneand a part of the stem-region was cloned and expressed in different expression systems. In E. coli-cells the fucosyltransferase was expressed as a “his-tag”- fusion-protein and isolated from the cell lysate. The recombinant protein was insoluble and could only be refolded in very small amounts. The expression of a MBP-FucT V fusion-protein resulted in a formation of soluble enzyme. None of the different FucT V constructs expressed in E. coli showed enzymatic activity. To produce the fucosyltransferase in eucaryotic cell lines the protein was fused to the signal-sequence of the human trace protein. The mamalien cell lines CHO and HEK 293 expressed the protein with an amount of 0.2–1mg/l. The insect cell line BTI-TN-5B1-4 from Trichoplusia ni produced 1 mg/l fucosyltransferase V using recombinant baculoviruses. Stable transected BTITN- 5B1-4-cells expressed the protein with an amount of 10–12 mg/l. fucosyltransferase V produced in eukaryotic cells was active and a great proportion was expressed in a dimeric form. The intermolecular disulfide-bridges forming the dimers could be reduced to a monomeric form with DTT in a concentration of 1mM retaining full enzymatic activity. Site directed mutagenesis changing different cysteine-residues to serin showed that Cys64 is responsible for forming intermolecular bridges. Cys156 —an amino-acid involved in GDPfuc-binding— could be changed to Ser without loss of activity. fucosyltransferase V produced in eukaryotic cells was glycosylated and exhibits a high measure of heterogenicity. Deglycosylation with N-glycosidase F led to a lower molecular weight and the signal appearing in SDS-PAGE was focused to a distinct band. Analyses with specific lectins showed a dominating level of high-mannose N-glycans on fucosyltransferase V expressed in insect cells. Hepta-peptide libraries were selected against recombinant fucosyltransferase V to develop specific inhibitors using the phage display technology. The use of a library of circular peptides led to specific ligands of the fucosyltransferase which showed no significant inhibitoric effect.en
dc.language.isodede
dc.publisherStaats- und Universitätsbibliothek Hamburg Carl von Ossietzky
dc.rightshttp://purl.org/coar/access_right/c_abf2
dc.subject.ddc540 Chemie
dc.titleExpression und Charakterisierung der humanen Fucosyltransferase Vde
dc.title.alternativeExpression and characterization of the human fucosyltransferase Ven
dc.typedoctoralThesis
dcterms.dateAccepted2005-06-17
dc.rights.ccNo license
dc.rights.rshttp://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
dc.subject.bcl30.99 Naturwissenschaften allgemein: Sonstiges
dc.subject.bcl35.71 Biochemische Methoden
dc.subject.bcl35.74 Enzyme, Hormone, Vitamine
dc.subject.bcl35.79 Biochemie: Sonstiges
dc.subject.gndFucose
dc.subject.gndGlycosyltransferasen
dc.type.casraiDissertation-
dc.type.dinidoctoralThesis-
dc.type.driverdoctoralThesis-
dc.type.statusinfo:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.thesisdoctoralThesis
tuhh.opus.id2855
tuhh.opus.datecreation2006-05-24
tuhh.type.opusDissertation-
thesis.grantor.departmentChemie
thesis.grantor.placeHamburg
thesis.grantor.universityOrInstitutionUniversität Hamburg
dcterms.DCMITypeText-
tuhh.gvk.ppn519667263
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:18-28555
item.advisorGNDBredehorst, Reinhard (Prof. Dr.)-
item.grantfulltextopen-
item.languageiso639-1other-
item.fulltextWith Fulltext-
item.creatorOrcidMünster, Jan-
item.creatorGNDMünster, Jan-
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen
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